细胞侵袭 | 肺癌(PC-9)细胞侵袭实验案例
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2026-02-05
实验所用产品：
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40183ES |
一、Transwell小室基底膜制备
试剂预冷：实验前，将Ceturegel®基质胶放置于冰上，于4°C液化。实验前将所需枪头放入4°C冰箱充分预冷。
铺胶与凝胶化：全程在冰上操作。用预冷的无血清培养基将基质胶按 1:8 比例稀释，并用预冷枪头轻柔混匀。立即吸取 80 μL 稀释液，垂直加入Transwell小室的上室，轻轻晃动小室使胶均匀覆盖膜表面。将小室置于37°C培养箱中，孵育 3小时，使基质胶完全凝固。
二、实验细胞准备
细胞饥饿：选取生长状态良好的PC-9细胞，在实验前用无血清培养基饥饿处理 24小时。
细胞悬液制备：消化细胞，用PBS清洗后，使用无血清培养基重悬。通过细胞计数，将密度调整至 1×10⁵ ~ 5×10⁵个/mL 的范围内（具体密度需根据细胞自身的侵袭能力强弱进行预实验优化）。
三、细胞接种与共培养
接种细胞：吸弃Transwell小室上室中未结合的液体。取 500 μL 制备好的细胞悬液，加入小室上室，确保细胞分布均匀。
建立趋化梯度：在培养板下室（通常为6孔板）中加入 1.5 mL 含 10% FBS（或其他趋化因子）的完全培养基。
关键提示：需确保小室底部膜与下室液体完全接触，中间无气泡，否则会削弱趋化作用。
孵育培养：将组装好的培养板置于37°C、5% CO₂培养箱中，常规培养 24小时。
四、固定、染色与结果分析
固定：培养结束后，取出Transwell小室。
关键步骤：用湿润的棉签，非常轻柔地擦拭上室膜表面，以彻底擦除未侵袭的细胞及残留的基质胶，仅保留穿透至膜底面的细胞。将小室浸入盛有 4% 多聚甲醛 的容器中，室温固定 30分钟。
清洗与染色：固定后，弃去固定液，用PBS清洗小室三次。加入 0.1%结晶紫染色液，室温染色 10分钟。
漂洗与观察：染色后，弃去染液，用PBS充分清洗小室以去除多余染料。
细胞计数与数据分析：将小室晾干后，置于光学显微镜下观察并拍照。随机选择至少5个不同的视野，计数每个视野中穿过膜并贴附于底面的细胞数。计算各组（如对照组与实验组）的平均穿膜细胞数。
实验结果：与对照组相比，药物处理组的穿膜细胞数显著减少，表明该药物对PC-9细胞的侵袭有抑制作用。
| 图1：对照组 | 图2：实验组 |
（数据来源：海南大学）
细胞侵袭实验小贴士
1.铺胶：基质胶铺制需全程冰上操作，枪头、离心管等耗材应提前预冷，以防胶体在操作过程中提前聚合，导致铺胶不均，影响屏障均一性。
2. 细胞：细胞需经充分无血清饥饿，以消除血清背景干扰。接种密度应通过预实验精确优化。
3. 气泡：组装小室与培养板时，务必检查并确保小室底部膜与下室含趋化剂的培养液之间无气泡。
4. 培养：侵袭培养时间因细胞类型而异，需通过预实验确定（通常12-48小时）。
5. 擦拭：用棉签擦拭上室未侵袭细胞时，动作必须轻柔、一致，且仅擦拭一次。
6. 计数：应在显微镜下随机选择至少5个不重叠的视野（避开膜边缘区域）进行计数，取平均值。
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