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实验所用产品

产品货号	产品名称
40192ES	基质胶 Ceturegel® Matrix,Phenol Red-Free,LDEV-Free Plus(同康宁matrigel胶)

 

1.样本制备

将8周龄的C57雄性小鼠断颈处死，置于酒精中浸泡5分钟消毒。在无菌操作环境下，截取约8 cm的小肠组织，放入4℃预冷的DPBS溶液中。

2.样本清洗

使用10 mL DPBS溶液清洗小肠组织2次。

3.样本处理

用手术剪将小肠组织纵向剖开，使用无菌刀片轻轻刮去肠腔表面的肠绒毛，此操作重复3次。随后，使用10 mL DPBS清洗组织3次。接着，将组织剪成约2 mm宽的小块，再用10 mL DPBS清洗3次。

4.样本消化

向组织碎片中加入10 mL DPBS及100 μL 0.5 M EDTA溶液，轻轻混匀。置于4°C、90 rpm的摇床中消化30分钟。

5.洗涤

消化完成后，弃去含有EDTA的上清液。加入10 mL 0.1% BSA溶液清洗组织沉淀，重复此洗涤步骤2次。

6.收集细胞悬液

向洗涤后的组织中加入10 mL 0.1% BSA溶液，反复吹打。取少许悬液镜检，观察类器官样结构释放情况。将全部组织悬液通过70 μm细胞滤网过滤以收集细胞团。重复此吹打与过滤步骤2次。

7.洗涤

将步骤6中收集的滤液在1000 rpm、4℃条件下离心3分钟，弃去上清，获得隐窝/类器官样结构沉淀。

8.混合物形成

用180 μL Ceturegel®基质胶与60 μL基础培养基的混合液（总体积240 μL，基质胶与培养基比例为3:1）重悬步骤7获得的小肠隐窝沉淀。轻轻吹打混匀，置于冰上备用。

9.铺板

将混合悬液种植于24孔板各孔底部正中央，每孔接种30 μL。将培养板置于37℃、5% CO₂恒温培养箱中，孵育约30分钟，使基质胶完全凝固。

10.培养

待基质胶凝固后，沿孔壁缓慢加入预温的小肠类器官专用完全培养基，每孔500 μL。将培养板放回37℃、5% CO₂培养箱中培养。每隔3天更换一次新鲜培养基，并观察类器官的生长与形态。

图1：Day1培养情况	图2：Day3培养情况	图3：Day5培养情况	图4：Day7培养情况

                                    

 （数据来源：北京大学）

 

类器官构建实验小贴士

1.样本处理：无菌操作，快速剔除坏死组织，保持样本低温，确保起始细胞活性。

2.消化过程：严格控制消化液浓度、温度与时间，通过镜检及时终止，避免过度消化。

3.基质胶操作：全程冰上操作，快速重悬与铺板，防止胶体凝固，确保点胶位置居中。

4.培养维持：使用新鲜培养基，定期轻柔换液，保持培养环境稳定，勤于镜检观察形态。

 

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