细胞侵袭 | 黑色素瘤(B16F10)细胞侵袭实验案例
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2026-02-05
实验所用产品：
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40183ES |
一、Transwell小室基底膜制备
基质胶稀释：将Ceturegel® 置于冰上，于4°C完全融化。使用预冷的吸头将其混合均匀。在冰上，用预冷的无血清 1640培养基 按 1:8 比例进行稀释，并立即混匀。
铺胶与凝胶化：用预冷吸头吸取 80 μL 稀释好的基质胶，垂直加入Transwell小室的上室，轻轻晃动使其均匀平铺。将小室置于37°C培养箱中，静置 3小时，使基质胶完全凝固。
水化与检查：吸弃小室中未结合的液体。加入 100 μL 无血清1640培养基，于37°C培养箱中水化 30分钟。水化后，吸弃液体，并检查下室是否有液体渗入。若无渗漏，表明包被成功，可用于后续实验。
二、实验细胞准备与处理
细胞饥饿：在实验前 12-24小时，将生长状态良好的B16F10细胞更换为无血清培养基进行饥饿处理。
细胞悬液制备：消化饥饿处理后的细胞，用含 1% FBS 的1640培养基终止消化并制成单细胞悬液。离心（1000 rpm， 3 min）后弃上清。
对照组：用含 1% FBS 的1640培养基重悬细胞，并将密度精确调整至 2.5×10⁵个/mL。
实验组：用含特定药物的 1% FBS 1640培养基重悬细胞，并调整至相同密度。
三、细胞接种与共培养
建立趋化梯度：在24孔板的下室加入 600 μL 含 20% FBS 的1640完全培养基作为趋化剂。
接种细胞：用镊子将包被好的Transwell小室放入24孔板中。分别取 200 μL 对照组或实验组细胞悬液（即含 5×10⁴个细胞），小心加入对应的小室上室。
孵育培养：将培养板置于37°C、5% CO₂培养箱中，常规培养 48小时。
四、固定、染色与结果分析
固定：培养结束后，取出Transwell小室，弃去培养液。用湿润的棉签，非常轻柔地擦拭上室内的基质胶及未侵袭的细胞。在24孔板干净的孔中加入 600 μL 4% 多聚甲醛，将小室放入，室温固定 20分钟。
清洗：弃去固定液，用PBS洗涤小室一次。
染色：在24孔板干净的孔中加入适量 0.1%结晶紫染色液，将小室放入，室温染色 20分钟。染色后，取出小室，用PBS洗涤三次。
观察与计数：将小室适当风干后，置于光学显微镜下观察。随机选择至少5个不同的视野进行拍照。分别计数对照组与各实验组的穿膜细胞数，并计算平均值。
实验结果：与对照组相比，经多药物处理的实验组穿膜细胞数显著减少，表明该药物对B16F10细胞侵袭有抑制作用。
| 图1：对照组 | 图2：实验组 |
（数据来源：中国药科大学）
细胞侵袭实验小贴士
1.铺胶：基质胶铺制需全程冰上操作，枪头、离心管等耗材应提前预冷，以防胶体在操作过程中提前聚合，导致铺胶不均，影响屏障均一性。
2. 细胞：细胞需经充分无血清饥饿，以消除血清背景干扰。接种密度应通过预实验精确优化。
3. 气泡：组装小室与培养板时，务必检查并确保小室底部膜与下室含趋化剂的培养液之间无气泡。
4. 培养：侵袭培养时间因细胞类型而异，需通过预实验确定（通常12-48小时）。
5. 擦拭：用棉签擦拭上室未侵袭细胞时，动作必须轻柔、一致，且仅擦拭一次。
6. 计数：应在显微镜下随机选择至少5个不重叠的视野（避开膜边缘区域）进行计数，取平均值。
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