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实验所用产品

产品货号	产品名称
40192ES	基质胶 Ceturegel® Matrix,Phenol Red-Free,LDEV-Free Plus(同康宁matrigel胶)

1. 消化酶配制

配制复合消化酶HRA工作液：取4.7 mL无血清基础培养基，依次加入200 μL H液、100 μL R液和30 μL A液，混合均匀。在管身标记名称与日期。

2. 样本预处理

将肿瘤组织置于无菌培养皿中，使用手术剪和镊子仔细去除肉眼可见的坏死（黑色）部分及主要血管（红色）部分。随后，用足量无血清基础培养基清洗组织块数次。

3. 样本处理

向清洗后的组织中加入少量无血清基础培养基，使用手术剪或组织剪将其彻底剪碎至糊状。

4. 第一次消化

向剪碎的组织糊中加入预先配制好的HRA消化酶工作液，轻轻吹打混匀后，转移至离心管中。将离心管置于37℃摇床中，以440 rpm的转速消化15分钟。消化期间需随时取样镜检，当观察到大量单个细胞或理想大小的细胞团块时，立即加入1.5倍消化液体积的含血清完全培养基终止消化。

5. 细胞悬液收集

将消化终止后的混合液通过细胞筛网过滤至50 mL离心管中，以收集含有单细胞/细胞团的滤液。将滤液分装至15 mL离心管，在350 g的离心力下离心4分钟，获得细胞沉淀。保留过滤后剩余的未消化完全的组织块，用于二次消化。

6. 第二次消化

向保留的组织块中加入新的无血清基础培养基，并重复步骤4和步骤5的消化与离心过程（即加入HRA消化、终止、过滤、离心），以获得更多的细胞沉淀。将两次消化所得的细胞沉淀合并。

7. 混合物形成

弃去离心后的上清液，用预冷的Ceturegel®基质胶重悬最终的细胞沉淀。建议重悬后细胞密度约为10⁶个细胞/每50μL基质胶。重悬后的混合液需始终置于冰上，并尽快进行后续操作，以防基质胶凝固。

8. 铺板

将基质胶-细胞混合悬液种植于24孔板各孔底部中央，每孔30-50 μL，注意避免悬液接触孔壁。随后将培养板置于37℃、5% CO₂培养箱中静置孵育约30分钟，使基质胶完全凝固。

9. 培养

待基质胶凝固后，沿孔壁缓慢加入预温的类器官专用完全生长培养基，每孔800 μL，确保胶滴被完全浸没。将培养板放回培养箱中常规培养，每隔3天更换一次新鲜培养基，并定期在显微镜下观察类器官的形成与生长状态。

图1：Day1培养情况	图2：Day3培养情况	图3：Day5培养情况

 

                                

 （数据来源：空军军医大学）

 

类器官构建实验小贴士

1.样本处理：无菌操作，快速剔除坏死组织，保持样本低温，确保起始细胞活性。

2.消化过程：严格控制消化液浓度、温度与时间，通过镜检及时终止，避免过度消化。

3.基质胶操作：全程冰上操作，快速重悬与铺板，防止胶体凝固，确保点胶位置居中。

4.培养维持：使用新鲜培养基，定期轻柔换液，保持培养环境稳定，勤于镜检观察形态。

 

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