永利3044(中国集团)有限公司官网

实验所用产品

产品货号	产品名称
40192ES	基质胶 Ceturegel® Matrix,Phenol Red-Free,LDEV-Free Plus(同康宁matrigel胶)

 

1.样本制备

将出生后第2-3天（P2-3）的小鼠断颈处死，体表喷洒酒精消毒。在无菌环境下取出小鼠耳蜗，置于预冷的HBSS缓冲液中。使用精细镊子小心去除附着于耳蜗上的结缔组织与多余组织。

2.样本消化

从HBSS中取出耳蜗，在体视镜下分离出基底膜组织。首先，将其置于消化液中，于37℃条件下消化20分钟，以解离感觉上皮片层。随后，用镊子收集感觉上皮细胞团，转入TrypLE消化液中，于37℃条件下继续消化45分钟，以充分解离为单个或小团细胞。

3.收集细胞悬液

消化完成后，加入1 mL DMEM/F12完全培养基以终止消化反应。用移液器轻柔吹打细胞悬液约20次，然后通过300目（孔径约40-50 μm）细胞筛网进行过滤，以去除未消化的组织团块。将滤液以1000 rpm转速离心4分钟，弃去上清，获得耳蜗上皮细胞沉淀。

4.混合物形成

用预先配制好的、含有5% Ceturegel®基质胶的耳蜗类器官完全培养基，重悬步骤3中获得的细胞沉淀。根据细胞计数，调整重悬体积以获得所需细胞密度。

5.铺板

细胞与Ceturegel®基质胶的混合悬液种植于96孔U型底超低吸附培养板中，每孔接种约3000个细胞，悬液体积可根据实验优化（通常为50-100 μL）。

6.培养

将培养板置于37℃、5% CO₂的培养箱中培养。培养期间，每两天更换一半体积的新鲜培养基（即半换液）。通常在培养4至6天后，可在显微镜下观察到典型的耳蜗类器官结构形成。

图1：Day6培养情况	图2：Day10培养情况

 （数据来源：南京大学摸索动物所）

 

类器官构建实验小贴士

1.样本处理：无菌操作，快速剔除坏死组织，保持样本低温，确保起始细胞活性。

2.消化过程：严格控制消化液浓度、温度与时间，通过镜检及时终止，避免过度消化。

3.基质胶操作：全程冰上操作，快速重悬与铺板，防止胶体凝固，确保点胶位置居中。

4.培养维持：使用新鲜培养基，定期轻柔换液，保持培养环境稳定，勤于镜检观察形态。

 

相关产品：