细胞侵袭 | 乳腺癌(MDA-MB-231)细胞侵袭实验案例
20023
2026-02-05
实验所用产品：
|
产品货号 |
|
|
40183ES |
一、Transwell小室基底膜制备
基质胶解冻与稀释：将Ceturegel®基质胶置于冰上，于4°C冰箱过夜完全融化，所有后续操作均在冰上进行。用预冷的无血清培养基按 1:8 比例进行稀释。
铺胶：用预冷的枪头垂直吸取 约60 μL 稀释好的基质胶，轻轻加入Transwell小室的上室，轻轻晃动小室使胶均匀铺满膜表面，注意避免产生气泡。
凝胶化：将包被好的小室置于37°C培养箱中，静置 1-3小时，使基质胶完全聚合成凝胶。注意：聚合时间不宜超过8小时，以免凝胶过度脱水开裂。
二、实验细胞准备与饥饿处理
细胞饥饿：在实验前 12-24小时，将生长状态良好的231乳腺癌细胞更换为无血清培养基进行培养，以消除基础血清对迁移行为的背景刺激。
细胞悬液制备：消化饥饿处理后的细胞，用无血清培养基重悬并离心收集细胞。用PBS轻柔洗涤细胞1-2次，以彻底去除残留的胰酶和血清。最后，用无血清培养基重悬细胞，并使用细胞计数板将密度精确调整至 1×10⁵ ~ 5×10⁵个/mL（具体密度需根据细胞状态及预实验确定）。
三、细胞接种与共培养
建立趋化梯度：在24孔板的下室加入 500 μL 含 10% FBS 的完全培养基作为趋化剂。
注意：添加时需避免液体冲击产生气泡，确保小室底部膜与下室液体完全接触，否则会削弱甚至阻断趋化作用。
安装小室与接种细胞：用镊子将铺好胶并已凝固的小室放入24孔板中，检查确保小室底部与下室液体之间无气泡。取制备好的细胞悬液 200 μL（即含有预定数量的细胞），小心加入Transwell小室的上室。操作时应避免产生气泡或划伤基质胶层。
四、培养、固定、染色与结果分析
孵育培养：将组装好的培养板置于37°C、5% CO₂培养箱中常规培养。培养时间通常为 24-48小时，具体时长需根据预实验中细胞侵袭穿过基质的速率来确定。
固定与染色：
吸液与擦拭：培养结束后，取出小室，小心吸弃上室内的培养基及细胞。
注意：用湿润的棉签，非常轻柔地擦拭上室底面（即基质胶面），以彻底擦除未发生侵袭的细胞。此步骤需谨慎操作，避免破坏已穿透至膜下表面的细胞。
固定：将小室放入盛有 4%多聚甲醛 的容器中，室温固定 15-30分钟。
清洗：固定后，用PBS浸洗小室两次。
染色：用 0.1%结晶紫染色液 对穿过膜的细胞染色 10-20分钟。
漂洗：染色后，用PBS轻柔漂洗小室数次，直至洗脱液无色。
细胞计数与数据分析：将小室室温晾干后，置于光学显微镜下观察。随机选择至少5个不同的视野（应避开膜的边缘区域），拍照并计数每个视野中穿过膜并被染色的细胞数。
实验结果：基因敲低组与对照组相比，穿膜细胞数减少；基因过表达组与对照组相比，穿膜细胞数增多。表明该基因对MDA-MB-231细胞的侵袭能力有影响。
| 图1：对照组 | 图2：敲低组 | 图3：过表达组 |
图：（数据来源：兰州大学）
细胞侵袭实验小贴士
1.铺胶：基质胶铺制需全程冰上操作，枪头、离心管等耗材应提前预冷，以防胶体在操作过程中提前聚合，导致铺胶不均，影响屏障均一性。
2. 细胞：细胞需经充分无血清饥饿，以消除血清背景干扰。接种密度应通过预实验精确优化。
3. 气泡：组装小室与培养板时，务必检查并确保小室底部膜与下室含趋化剂的培养液之间无气泡。
4. 培养：侵袭培养时间因细胞类型而异，需通过预实验确定（通常12-48小时）。
5. 擦拭：用棉签擦拭上室未侵袭细胞时，动作必须轻柔、一致，且仅擦拭一次。
6. 计数：应在显微镜下随机选择至少5个不重叠的视野（避开膜边缘区域）进行计数，取平均值。
相关产品：
|
产品货号 |
产品名称 |
|
84051ES |
|
|
84052ES |
