细胞侵袭 | 宫颈癌(SiHa)细胞侵袭实验案例
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2026-02-05
实验所用产品：
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40183ES |
一、Transwell小室基底膜制备
基质胶稀释：将Ceturegel®基质胶置于冰上，于4°C完全融化，所有操作在冰上进行。用预冷的无血清 MEM培养基 按 1:8 比例进行稀释（即100 μL 基质胶加入800 μL 无血清培养基），稀释后终浓度约为 1 mg/mL（确保不超过3 mg/mL）。稀释后立即轻柔吹打混匀。
铺胶：立即用预冷枪头吸取 50 μL 稀释好的基质胶，逐滴加入Transwell小室的上室，通过轻轻震动摇匀，使胶均匀覆盖膜表面，液面厚度约 3 mm。注意避免产生气泡。
凝胶化与水化：
凝胶化：将铺胶后的小室置于37°C培养箱中，静置 2-4小时，使基质胶完全凝固。
水化：使用前，向每个小室上室加入 200 μL 无血清MEM培养基，于37°C培养箱中水化 30分钟。水化结束后，小心吸弃培养基。
二、实验细胞准备与饥饿处理
细胞饥饿：在实验前 12-24小时，将生长状态良好的Siha细胞（包括空病毒对照组与过表达病毒组）更换为无血清MEM培养基进行培养，以消除血清背景干扰。
细胞悬液制备：消化饥饿处理后的细胞，用含血清的培养基终止消化。离心后弃上清，用 PBS缓冲液 轻柔洗涤细胞1-2次。最后，用无血清MEM培养基重悬细胞，并使用细胞计数板将密度精确调整至 2.5×10⁵个/mL。
三、细胞接种与共培养
建立趋化梯度：在24孔板的下室加入 600 μL 含 20% FBS 的MEM完全培养基作为趋化剂。
接种细胞：取制备好的细胞悬液 200 μL（即约5×10⁴个细胞），小心加入Transwell小室的上室。操作时应避免产生气泡。
孵育培养：将组装好的培养板置于37°C、5% CO₂培养箱中，常规培养 48小时。
四、固定、染色与结果分析
固定：培养结束后，取出Transwell小室，弃去上下室的培养基。用湿润的棉签，非常轻柔地擦拭上室底面（即基质胶面），以彻底擦除未发生侵袭的细胞。用不含钙、镁离子的PBS缓冲液清洗小室两次。将小室放入盛有 4% 多聚甲醛 的容器中，室温固定 30分钟。
清洗与染色：固定后，弃去固定液，用PBS清洗小室三次。加入适量 0.1%结晶紫染色液，室温染色 30分钟。
漂洗与观察准备：染色后，用 去离子水 轻柔漂洗小室数次，直至洗脱液无色且无明显紫色。将小室室温晾干。
细胞计数与数据分析：将干燥后的小室置于光学显微镜下，在 10× 和 20× 物镜下观察并拍照。随机选择至少5个不同的视野，计数每个视野中穿过膜并被染色的细胞数。
实验结果：与对照组相比，过表达组穿膜细胞数显著增多，表明该基因对SiHa细胞侵袭能力有影响。
| 图1：对照组 | 图2：过表达组 |
（数据来源：中国医科大学）
细胞侵袭实验小贴士
1.铺胶：基质胶铺制需全程冰上操作，枪头、离心管等耗材应提前预冷，以防胶体在操作过程中提前聚合，导致铺胶不均，影响屏障均一性。
2. 细胞：细胞需经充分无血清饥饿，以消除血清背景干扰。接种密度应通过预实验精确优化。
3. 气泡：组装小室与培养板时，务必检查并确保小室底部膜与下室含趋化剂的培养液之间无气泡。
4. 培养：侵袭培养时间因细胞类型而异，需通过预实验确定（通常12-48小时）。
5. 擦拭：用棉签擦拭上室未侵袭细胞时，动作必须轻柔、一致，且仅擦拭一次。
6. 计数：应在显微镜下随机选择至少5个不重叠的视野（避开膜边缘区域）进行计数，取平均值。
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