细胞侵袭 | 人源胶质母细胞瘤(U-87)细胞侵袭实验案例
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2026-02-05
实验所用产品：
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40183ES |
一、Transwell小室基底膜制备
基质胶稀释与铺板：将Ceturegel®基质胶置于冰上，于4°C完全融化。用预冷的无血清培养基按 1:5 比例进行稀释，轻柔混匀。立即取适量稀释液（约60-100 µL，以均匀覆盖膜面为准）加入Transwell小室的上室。
凝胶化与水化：
凝胶化：将铺胶后的小室置于 37°C培养箱 中静置1-2小时，或置于超净台内 室温下风干（注：4℃环境不利于凝胶聚合，常规操作推荐37℃孵育），使基质胶完全凝固。
水化：使用前，向每个小室上室加入100-200 µL无血清培养基，于37°C培养箱中水化30分钟。水化结束后，小心吸弃培养基。
二、实验细胞准备
细胞悬液制备：消化处于对数生长期的U87细胞，用含血清的培养基终止消化。离心后弃上清，用PBS轻柔洗涤细胞1-2次。最后，用无血清培养基重悬细胞，并使用细胞计数板将密度精确调整至 5.0×10⁵个/mL（以实现每孔接种5×10⁴个细胞的目标）。
三、细胞接种与共培养
建立趋化梯度：在24孔板的下室加入 500 µL 含 10% FBS 的完全培养基作为趋化剂。
接种细胞与排除气泡：
取 100 µL 细胞悬液（含5×10⁴个细胞），小心加入Transwell小室的上室。
注意：下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失。在加样时要特别留心，一旦出现气泡，需将小室轻轻提起，去除气泡后，再将小室稳妥地放入培养板中。
孵育培养：将组装好的培养板置于37°C、5% CO₂培养箱中，常规培养 24小时（具体时间需根据细胞侵袭力及实验处理因素对细胞增殖的影响进行预实验优化）。
四、固定、染色与结果分析
固定：培养结束后，取出Transwell小室，弃去孔中培养液。用湿润的棉签，非常轻柔地擦拭上室膜表面，以彻底擦除未发生迁移/侵袭的细胞。用PBS清洗小室两次。将小室放入盛有 4% 多聚甲醛 的容器中，室温固定 30分钟。
风干：固定后，弃去固定液，将小室在通风处室温下适当风干（以膜变为不透明、无明显水渍为宜，避免过度干燥）。
染色与漂洗：加入 0.1%结晶紫染色液，室温染色 20分钟。染色后，弃去染液，用PBS清洗小室三次，以去除背景色。
细胞计数与数据分析：将小室室温晾干后，置于光学显微镜下观察。随机选择至少5个不同的视野（应避开膜的边缘区域），拍照并计数每个视野中穿过膜并被染色的细胞数。
实验结果：随着药物浓度的提升，穿膜细胞数减少，表明该药物对U87细胞侵袭有抑制作用。
| 图1：低浓度处理组 | 图2：中浓度处理组 | 图3：高浓度处理组 |
（数据来源：大庆油田总医院）
细胞侵袭实验小贴士
1.铺胶：基质胶铺制需全程冰上操作，枪头、离心管等耗材应提前预冷，以防胶体在操作过程中提前聚合，导致铺胶不均，影响屏障均一性。
2. 细胞：细胞需经充分无血清饥饿，以消除血清背景干扰。接种密度应通过预实验精确优化。
3. 气泡：组装小室与培养板时，务必检查并确保小室底部膜与下室含趋化剂的培养液之间无气泡。
4. 培养：侵袭培养时间因细胞类型而异，需通过预实验确定（通常12-48小时）。
5. 擦拭：用棉签擦拭上室未侵袭细胞时，动作必须轻柔、一致，且仅擦拭一次。
6. 计数：应在显微镜下随机选择至少5个不重叠的视野（避开膜边缘区域）进行计数，取平均值。
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