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准备工作：

1.20%葡萄糖母液（以100mL为例）

20g葡萄糖（60902ES），加入无菌去离子水（60168ES）定容至100mL，0.22μm（84309ES）过滤除菌，4℃保存。

2.10×YNB母液（以100mL为例）

6.7gYNB（60901ES），加入100mL蒸馏水（60170ES），60℃加热溶解，0.22μm（84309ES）过滤除菌，4℃保存。

液体培养基配制：

1. 向700 mL无菌去离子水（60168ES）加入100mL 10×YNB（60901ES）（终浓度0.67%YNB）

2. 加入0.64g DO Supplement

3. 搅拌至完全溶解，定容至900mL，pH调至5.8

4. 121℃高压灭菌20min

5. 冷却至50℃左右，无菌加入100mL 20%葡萄糖（60902ES）（终浓度2%）

6. 建议分装，4℃短期保存

固体培养基配制：

1. 配置A液：700mL无菌去离子水+100mL 10×YNB+0.64 g DO Supplement，定容900mL，高压灭菌

2. 配置B液：100mL 20g/L琼脂溶液（70101ES），高压灭菌

3. 灭菌后A、B均冷却至50℃，混合

4. 无菌加入100mL 20%葡萄糖，充分混匀

5. 无菌倒平板，室温凝固后4℃避光保存

简易快速配制：

1. 纯水900 mL，加入6.7g YNB，0.64g DO Supplement，搅拌溶解

2. 高压灭菌，冷却至50℃

3. 加入100 mL无菌20%葡萄糖，混匀

4. 液体培养基直接分装；固体培养基需提前单独融化琼脂后混合倒板

Q1：SD培养基的筛选原理是什么？

A1：SD培养基依赖酵母菌株的营养缺陷型和质粒上的营养互补标记完成筛选。例如，一个酵母菌株本身不能合成亮氨酸，如果培养基中缺少亮氨酸，它就无法生长；但如果转入的质粒带有 LEU2 标记基因，细胞就可以恢复亮氨酸合成能力，从而在SD/-Leu培养基上生长。所以SD的筛选逻辑是：培养基缺什么，酵母就必须靠质粒或外源基因补什么，能长出来的就是符合筛选条件的细胞。

Q2：为什么酵母在SD培养基上生长比较慢？

A2：SD营养丰富度低于YPD等复合培养基。尤其是多重缺陷培养基中，酵母可利用的营养成分更少，代谢压力更大，因此生长速度通常较慢。

Q3：如何选择 SD/-Leu、SD/-Trp、SD/-Ura 等不同类型？

A3：选择依据主要有两个：第一，看宿主菌株缺什么；第二，看质粒或载体补什么。例如：菌株缺亮氨酸，质粒带LEU2→可用SD/-Leu；菌株缺色氨酸，质粒带TRP1→可用SD/-Trp；菌株同时转入LEU2和TRP1两个质粒→可用SD/-Leu/-Trp；

酵母双杂交检测互作→常用SD/-Leu/-Trp/-His或更严格的SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade。

Q4：SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade 为什么筛选更严格？

A4：SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade 同时缺少亮氨酸、色氨酸、组氨酸和腺嘌呤，通常用于更高严格度的互作筛选。相比SD/-Leu/-Trp/-His，它要求更多报告基因被激活，因此可以降低部分假阳性，但也可能使弱互作克隆难以生长。因此，筛选严格度越高，不一定代表越适合所有实验，需要根据互作强弱和实验目的选择。

Q5：SD培养基可以加入3-AT吗？

A5：可以。3-AT常用于酵母双杂交实验中，主要用于抑制HIS3背景表达，降低自激活或假阳性。是否需要加入3-AT，以及添加浓度多少，需要根据bait蛋白自激活强度进行预实验优化。如果3-AT浓度过高，可能会抑制真实阳性克隆生长；如果浓度过低，可能无法有效降低背景。