离心柱法 | 大肠杆菌RNA提取
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2026-04-10
实验所用试剂设备清单
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货号 |
产品名称 |
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19301ES50 |
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10402ES |
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— |
无水乙醇 |
实验前准备
1．自备设备和试剂：台式离心机、振荡仪、水浴锅或金属浴，1.5 mL RNase-free 离心管，无水乙醇等。
2．首次使用前，在漂洗液W*瓶中加入4倍体积的无水乙醇，充分混匀后使用，并做好标记。如果发现漂洗液W*由于运输或保管不当造成容量严重不准，请用量筒定容后再加入4倍体积的无水乙醇。每次使用后将瓶盖盖紧，以保持漂洗液W*中的乙醇含量。
3．首次使用前，称取1 mg溶菌酶（19301-A，产品货号：10402ES）溶于1 mL缓冲液TE(pH 8.0)，充分混匀，即为1 mg/mL溶菌酶工作液。工作液分装-20℃保存，数周内稳定。
操作步骤
1．取1 mL大肠杆菌培养液（约5×105），12000 rpm离心2 min，弃上清。注：菌体不宜过量，过量会严重降低产量。起始处理量与细菌密度、种类等相关。注：上清残留量不宜超过20 μL。
2．针对革兰氏阴性菌：加入100 μL 1mg/mL溶菌酶工作液。涡旋振荡10 sec，室温孵育2 min。重复振荡孵育3次。
3．短暂离心收集细胞，弃上清。
4．涡旋振荡重悬分散细胞。加入500 μL裂解液LB，反复吹打混匀，并剧烈涡旋振荡至无明显不溶物。注：若处理后，仍有不溶物，可12,000 rpm离心2 min，取上清液进行下一步。
5．将DNA清除柱B4套入2 mL收集管中，备用。
6．加入上述裂解物至DNA清除柱B4中，12000 rpm离心1 min，保留滤过液。注：离心后，若滤膜仍有液体残留，可延长离心时间至5 min。
7．加入250 μL无水乙醇，立即吹打混匀。注：可能会形成絮状沉淀，属于正常现象。
8．将上述混合物加入RNA吸附柱B4中，12000 rpm离心1 min，弃掉废液。注：混合液每次最大加入体积700 μL，可分多次离心。
9．加入500 μL去蛋白液PL，12000 rpm离心30 sec，弃掉废液。
10．将RNA吸附柱B4放回收集管中，加入500 µL漂洗液W*，12000 rpm离心30 sec，弃废液。注：确保漂洗液W*已添加无水乙醇。重复一遍步骤10。
11．将RNA吸附柱B4放回收集管，空柱12000 rpm室温离心2 min，以除去残留的漂洗液W*。
12．将RNA吸附柱B4放入新的1.5 mL RNase-free离心管中，在RNA吸附柱B4中央加入50 µL RNase-free H2O，室温放置1 min。然后12000 rpm离心1 min。收集滤液，即为RNA溶液。
13．样品可置于-20℃短期保存，-80℃长期保存。
质检结果—RNA浓度和纯度
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样本序号 |
浓度（nanodrop）ng/μL |
A260/A280 |
A260/A230 |
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1 |
123.949 |
2.15 |
1.09 |
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2 |
241.394 |
2.15 |
2.16 |
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3 |
198.421 |
2.16 |
1.56 |
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4 |
171.154 |
2.16 |
1.88 |
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5 |
220.891 |
2.15 |
2.16 |
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6 |
195.429 |
2.16 |
2.24 |
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7 |
187.918 |
2.16 |
1.83 |
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8 |
207.775 |
2.15 |
2.28 |
质检结果—RNA完整度分析
数据来源：北京某高校老师
实验结论
采用永利3044集团官网离心柱法细菌RNA提取试剂盒（19301ES50）提取8个大肠杆菌样本，通过Nanodrop检测RNA的浓度和纯度、琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整度，结果显示：提取的大肠杆菌RNA浓度较高（除第一个样本由于操作失误降解），其余7个样本完整度较好，28S：18S大约2：1，能够满足后续RNA-seq要求。
