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微量RNA提取技术是应对低生物量样本核酸分析的关键技术。随着生物标志物研究向非侵入性和精准化方向发展，从低起始量样本中获得高质量、高完整度的RNA已成为连接临床样本与下游分子分析的核心桥梁。

一、微量RNA提取的应用场景

1. 临床医学与精准医疗

• 穿刺活检样本：从细针穿刺获取的少量肿瘤组织中提取RNA，用于基因表达谱分析、分子分型及靶向治疗指导。
• 液体活检：从外周血中分离循环肿瘤细胞（CTCs）或外泌体，提取其中的微量RNA，用于癌症早期筛查和动态监测。
• 微量组织样本：如内镜活检、冷冻切片、激光显微切割（LMD）获得的特定细胞群，用于研究局部病灶的转录活性。

2. 发育生物学与干细胞研究

• 从早期胚胎、单个卵裂球或少量干细胞中提取RNA，研究发育过程中的基因调控网络。
• 类器官（Organoid）研究中，因样本量小，需高效提取微量RNA。

3. 法医学与古RNA研究

• 从降解样本（如陈旧组织、福尔马林固定石蜡包埋组织，FFPE）中提取残留RNA，辅助死亡时间推断或病原体检测。
• 古代样本中古RNA的探索，虽罕见，但具研究潜力。

4. 基础科研领域

• 模式生物微量组织（如昆虫幼虫、植物分生组织、胚胎组织等）的RNA提取，支撑基因表达分析、转录组测序等研究。
• 单细胞RNA提取，适配单细胞测序技术，解析细胞异质性。
• 低丰度RNA样本（如特定细胞亚群、微量病原体）的提取，满足小众研究方向的样本处理需求。

二、微量RNA提取与常规RNA提取的区别

比较维度	常规RNA提取	微量RNA提取
起始样本量	细胞数较多（>106个），组织量较大（>10mg）	极少细胞（<105个）或微量组织（<5mg）
操作体系	使用标准离心管（1.5ml）	使用微量离心管（0.2ml或0.5ml）以减少体积损失
防RNase污染要求	常规防护（戴手套、使用无酶耗材）	极高要求，必须使用RNase-free试剂、专用器具、负压操作台
裂解液与载体	标准裂解体系	常添加Carrier RNA，提高RNA沉淀效率
洗脱体积与浓度富集	为了获得更多总量，常使用较大体积（50-100μL）的洗脱液	为满足下游实验的加样需求，通常采用最小体积（如15-30μL）洗脱，以获得高浓度RNA
基因组DNA去除策略	可通过柱上DNase I消化或后续DNA酶处理，操作空间大	微量样本对操作步骤的敏感性高，倾向于使用柱上DNase I消化

三、微量RNA提取原理

1. 细胞裂解与RNA释放

使用含强变性剂（如异硫氰酸胍）和β-巯基乙醇的裂解液，迅速破坏细胞结构，灭活RNase；通过蛋白酶K辅助降解蛋白质，释放RNA至溶液中。以达到裂解迅速、彻底，防止RNA降解的目的。

2. RNA与硅胶膜结合

将裂解液与乙醇混合后上样至离心柱。在高盐环境下（如盐酸胍存在），RNA通过磷酸骨架与硅胶膜表面的硅醇基团发生特异性结合。DNA、蛋白质、多糖等杂质被去除。

3. 杂质洗涤

使用含乙醇的洗涤缓冲液进行两次以上离心洗涤。去除残留蛋白质、盐分、细胞碎片及有机溶剂。需注意洗涤充分但避免过度干燥膜，以免影响洗脱效率。

4. RNA洗脱

加入无RNase的水或低盐缓冲液（如DEPC水或Buffer RNase-free），在低离子强度下使RNA从硅胶膜上解离。离心收集洗脱液，获得纯化RNA。微量提取洗脱体积小（通常15–30 μL），以提高浓度；预热洗脱液可提升效率。

四、RNA的质检方法

1. 浓度与纯度检测（分光光度法）

使用NanoDrop或超微量分光光度计测定：

• A260/A280比值：评估蛋白质污染。理想值为1.8–2.0。
• A260/A230比值：评估有机溶剂或盐类污染。理想值>2.0。

2. 完整性检测

琼脂糖凝胶电泳：

• 观察28S和18S rRNA条带（真核生物），28S:18S ≈ 2:1 表示完整。
• 出现拖尾或弥散条带提示降解。

微流控电泳（如Agilent Bioanalyzer、TapeStation）：

• 提供RNA完整性数（RIN值），RIN > 7 表示适合高通量测序。
• 可检测微量样本，灵敏度高。

（官网推文图）

1. 功能活性验证

qRT-PCR检测管家基因（如GAPDH、β-actin）：

• Ct值稳定、扩增曲线良好，表明RNA未降解且无抑制物。

逆转录效率测试：通过合成cDNA后检测特定基因表达水平。

2. 特殊样本的附加检测

FFPE样本：需评估去交联效果和片段化程度。

液体活检RNA：常为小片段RNA，需使用小RNA专用试剂盒检测。

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