调节性 T 细胞（Treg）是维持免疫耐受、抑制过度炎症反应的核心 CD4+ T 细胞亚群，在自身免疫病、移植免疫、肿瘤免疫及炎症调控研究中至关重要。小鼠 Treg 极化试剂盒，专为小鼠初始 CD4+ T 细胞体外定向诱导设计，提供标准化极化体系，高效、稳定、可重复获得高纯度功能性 iTreg 细胞。
产品组分
| 组分编号 | 组分名称 | 外观 | 参考使用浓度 | 92678ES10（10 mL体系） | 92678ES60（100 mL体系） |
| 92678ES-A | Mouse IL-2 Protein | 冻干粉 | 10 ng/mL | 5 μg | 5 μg |
| 92678ES-B | Mouse TGF-β1 Protein | 冻干粉 | 2 ng/mL | 5 μg | 5 μg |
| 92678ES-C | Anti-mouse CD3ε mAb | 液体 | 10 μg/mL | 100 μg | 1 mg |
| 92678ES-D | NA/LE Syrian Hamster anti-mouse CD28 mAb | 液体 | 2 μg/mL | 100 μg | 200 μg |
| 92678ES-E | Anti-mouse IL-4 Recombinant mAb | 液体 | 10 μg/mL | 100 μg | 1 mg |
| 92678ES-F | Anti-mouse IFNγ Recombinant mAb | 液体 | 10 μg/mL | 100 μg | 1 mg |
| 92678ES-G | β-巯基乙醇（14.3 M） | 液体 | 55 μM | 100 μL | 100 μL |
CD4+ T细胞的Treg极化诱导实验方案：
1. 包被抗CD3ε/CD28抗体以激活T细胞
1.1使用无菌PBS将抗小鼠CD3ε单克隆抗体和抗小鼠CD28单克隆抗体分别稀释至工作浓度（10 µg/mL和2 µg/mL）。
1.2向48孔细胞培养板的每孔加入500 µL上述抗体混合液，确保液体覆盖孔底。
1.3将培养板置于4°C冰箱中，包被过夜（约16-18小时）。
2. 接种细胞并启动Treg极化
2.1次日，吸弃孔内包被液，用预冷的无菌PBS轻柔洗涤孔板两次，以去除未结合的抗体。
2.2将经CD4+ T细胞分选磁珠（货号：37607ES10）分选获得的、纯度>95%的小鼠脾脏CD4+T细胞，以 4−5×10^5cells/mL的浓度重悬于Treg极化完全培养基中。
Treg极化完全培养基配方：RPMI-1640基础培养基，补充10%胎牛血清、55 µM β-巯基乙醇、10 ng/mL重组小鼠IL-2、
2 ng/mL重组小鼠TGF-β1、10 µg/mL抗小鼠IFN-γ功能性抗体及10 µg/mL抗小鼠IL-4功能性抗体。
2.3取500 µL细胞悬液接种至已包被的48孔板的每个孔中。置于37°C、5% CO₂的细胞培养箱中培养。
3. 培养维持与细胞扩增
3.1培养48小时后，轻柔吹打并收集细胞悬液，300 ×g离心5分钟。
3.2弃上清，用新鲜的Treg极化完全培养基将细胞重悬，并将细胞密度调整至1×10^6 cells/mL，重新接种至新孔板中继续培养。
3.3此后，每12小时在倒置显微镜下观察细胞密度及状态。若细胞密度过高（例如 >2×10^6 cells/mL），则进行半量换液或按适当比例将细胞分至新的孔中，并补充新鲜Treg极化完全培养基，以维持细胞最佳生长状态。
4. 收集细胞
培养至第5天，收集细胞，用预冷的PBS洗涤一次。
阴性对照组（Th0）设置
为评估极化的特异性，平行设置Th0阴性对照组。其流程与上述上述Treg诱导组基本相同，主要区别在于：
使用不同的维持培养基：使用Th0维持培养基，其组成为RPMI-1640基础培养基，补充10%胎牛血清、55 µM β-巯基乙醇、2 ng/mL重组小鼠IL-2，10 µg/mL抗小鼠IFN-γ及10 µg/mL抗小鼠IL-4功能性抗体。
注意：除上述培养基差异外，细胞接种、换液、密度监控均与Treg诱导组相同。
流式细胞术检测
1. 收集细胞：收集细胞，用PBS清洗细胞1遍，弃上清，再将细胞用PBS轻轻吹打重悬；
2. 计数：用细胞计数仪计数并计算细胞总数，300×g，离心5min，弃上清；
3. 死活染料染色：按照100μl/1e6浓度加入稀释好的死活染料Fixable Viability Dye 452(稀释方法参考说明书）;
4. 洗涤细胞：用PBS洗涤细胞，300×g，离心5min，去除残留的死活染料；
5. 细胞固定：用PBS将细胞按照1e7/ml重悬，100μl/孔加至96孔板，300×g，离心5min，弃上清；每孔加入200μl 1×Fixation/Permeabilization solution，室温避光放置15min;
6. 洗涤细胞：300×g，离心5min，弃上清；每孔加200μl PBS，300×g，离心5min洗涤细胞，去除残留的固定剂；
7. 细胞破膜：每孔加入200μl 1×Permeabilization Buffe，4~8℃冰箱孵育30min；
8. 细胞封闭：每孔加入100μl 1×BD Perm/Wash™ Buffer，并加入Mouse IgG进行细胞封闭（步骤7与步骤8可同时进行），随后300×g，离心5min，弃上清；
9. 孵育抗体：每孔加入100μl 10%FBS的PBS，并加入孵育抗体PE anti-mouse FOXP3 Recombinant Antibody和CD25 Monoclonal Antibody (BC96), Brilliant Violet™ 421 (抗体用量参考说明书）;
10. 洗涤细胞：300×g，离心5min，弃上清；每孔加200μl PBS，300×g，离心5min洗涤细胞，去除残留抗体，随后用100μl~200μl重悬细胞；
11. 上机检测。
注意事项
1.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。本产品仅作科研用途。
2.培养基中可以添加：1% 丙酮酸钠，L-谷氨酰胺，HEPES，青霉素-链霉素
3.分装于独立容器中，以减少冻融循环次数。
✅ 经典黄金组合，极化效率高
✅ 高活性质控，批次稳定
✅ 操作极简，周期短
✅ 黄金配比、省心便捷
| 组分名称 | 储存条件 |
| Mouse IL-2 Protein Mouse TGF-β1 Protein Anti-mouse CD3ε mAb NA/LE Syrian Hamster anti-mouse CD28 mAb Anti-mouse IL-4 Recombinant mAb Anti-mouse IFNγ Recombinant mAb | -25 ~ -15℃保存，收到货之后有效期1年。避免反复冻融。 |
| β-巯基乙醇 | 2-8℃保存 |
