人外周血单核来源树突状细胞的制备实验方案
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2026-06-11
一、PBMC复苏
复苏冻存的PBMC，室温300g离心5min。弃去上清，使用完全培养基RPMI 1640（41402ES）（含10% FBS40132ES和1%双抗60162ES）重悬细胞，并进行细胞计数与活率检测（活率应大于95%）。
二、单核细胞分选
方法A：贴壁纯化法（简便，适合常规实验）
1. 铺板：将分离得到的单个核细胞用含血清的完全培养基重悬，调整细胞密度至约1×106−2×106cells/mL，接种于6孔培养板中。
2. 贴壁：将培养板置于37℃、5% CO₂培养箱中静置培养2小时。此步骤利用单核细胞易贴壁的特性，使其与悬浮的淋巴细胞分离。
3. 去悬浮：轻轻吸弃培养基中的悬浮细胞（主要为淋巴细胞），并用温热的PBS（41403ES）轻轻洗涤培养孔1-2次，剩余的紧密贴壁细胞即为单核细胞。
方法B：CD14 磁珠分选法（高纯度，适合功能实验）
1. 重悬：PBMC 调整浓度至1×10⁸ cells/mL，用预冷分选缓冲液洗涤1次（4℃，300×g，8 min）。
2. 磁珠标记：将PBMC细胞加入分选磁珠，4℃孵育 30 min，轻柔混匀。
3. 磁分离：分选柱用3倍体积分选缓冲液润洗，加入细胞悬液，收集未结合细胞；用分选缓冲液洗柱3次，洗脱结合的CD14⁺单核细胞（纯度≥95%）。
三、单核细胞诱导为未成熟树突状细胞
1. 接种：用完全培养基RPMI 1640（含10% FBS和1%双抗）将分选后的CD14+细胞浓度调整至1-2×106 cells/mL。按每孔1 mL接种于24孔板中。
2. 诱导：立即加入重组人细胞因子IL-4（90105ES,50ng/mL）和GM-CSF（91102ES,100ng/mL），将24孔板(84013ES)置于37℃、5% CO2的培养箱中开始培养；
3. 观察：培养48h后，在显微镜下观察细胞状态。
4. 换液：若细胞贴壁良好：轻柔吸弃一半旧培养基，再缓慢加入等体积、含有相同浓度IL-4和GM-CSF的新鲜完全培养基；若细胞贴壁不佳或大量悬浮：无需弃去旧液，直接补加适量含有相同浓度细胞因子的新鲜完全培养基。继续培养：完成换液/补液后，将细胞继续培养72小时。形态观察：出现典型树突状突起，为未成熟MoDC（iMoDC）。
四、未成熟树突状细胞诱导为成熟树突状细胞
1. 换液：轻柔吹打收集的上述未成熟树突状细胞，300g离心10分钟。弃去上清。用新鲜完全培养基重悬细胞，并将密度调整至5×105cells/mL。
2. 接种：将细胞悬液接种至新的24孔板中，并加入成熟诱导因子混合物：TNF-α（90635ES,10 ng/mL）、IL-1β（90101ES,10 ng/mL）、IL-6（90107ES,50 ng/mL）和PGE2（60810ES，1μg/mL）。将细胞置于37°C、5% CO₂培养箱中继续培养48小时。培养结束后，即可获得成熟的树突状细胞，用于后续实验。
3. 形态观察：随着细胞成熟，细胞会逐渐变成悬浮状态，细胞体积增大，表面突起变得更加细长、明显，呈典型的“树突状”。
五、细胞收获与鉴定
1. 收获：收集上清中的悬浮细胞，贴壁残留细胞用预冷TrypLE Express(40134ES)消化 5 min，轻轻吹打收集，合并后用PBS洗涤2次（300×g，10 min）。
2. 计数与活力：台盼蓝染色(40207ES)，活细胞率需≥85%。
3. 表型鉴定（流式细胞术）
未成熟DC标志：CD11c⁺、CD14⁻、CD80⁻/low、CD86⁻/low、MHC II⁺、CD83⁻。
成熟DC标志：CD83⁺、CD80⁺、CD86⁺、HLA-DR⁺（MHC II）、CD14⁻。
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重组人GM-CSF:能够诱导单核细胞或DC前体细胞向DC分化，并促进DC的增殖和存活,还可以提高DC表面抗原水平，增强DC的抗原捕获和处理能力
重组人IL-4:抑制单核细胞向CD14+巨噬细胞分化，从而诱导其分化为未成熟DC
重组人IL-6、重组人TNF-α和重组人IL-1β：三因子组合可诱导DC的完全成熟
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产品分类 |
产品货号 |
产品名称 |
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细胞因子类 |
Human PBMC- derived Dendritic Cell Cytokine Set 人PBMC诱导分化树突状细胞细胞因子套装 |
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HiActi® Recombinant Human TNF-alpha Protein 重组人肿瘤坏死因子-α |
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HiActi® Recombinant Human IL-4 Protein 重组人白介素-4 |
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HiActi® Recombinant Human GM-CSF Protein 重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 |
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HiActi® Recombinant Human IL-1 beta Protein 重组人白介素-1β |
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HiActi® Recombinant Human IL-6 Protein 重组人白介素-6 |
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细胞培养类 |
RPMI1640培养基（含L-谷氨酰胺；不含丙酮酸钠，HEPES，双抗） |
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1× PBS 细胞培养级 |
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Fetal Bovine Serum Gold Pro 胎牛血清（特级） |
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PerfCell Tryzyme™ Express 酶 (1X)，含酚红 |
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Penicillin-Streptomycin (100×), Suitable for Cell Culture 细胞培养用青霉素-链霉素（双抗） |
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Prostaglandin (PG) E2 前列腺素E2 |
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抗体类 |
PE Mouse Anti-Human CD11c mAb |
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FITC Mouse Anti-Human CD14 mAb |
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APC Mouse Anti-Human CD80 mAb |
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APC Mouse Anti-Human CD86 mAb |
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PE Mouse Anti-Human HLA-DR mAb |
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PE Mouse Anti-Human CD83 mAb |
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PE Mouse Anti-Human HLA-DR mAb |
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耗材类 |
6孔细胞培养板(TC处理) |
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24孔细胞培养板（TC处理) |
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100 mm细胞培养皿（TC处理） |
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细胞刮刀，刮刀宽1.8 cm，可转动刮头，灭菌 |
