人单核细胞来源破骨细胞培养方案
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2026-06-11
实验步骤
一、人单核细胞获取
1. PBMC分离
①采集外周血于EDTA抗凝采血管中，将血液混匀于无菌50 mL管(83507ES)中，PBS 1:1（41403ES）稀释血液标本
②取干净的50 mL管，淋巴细胞分离液(40503ES)、血液、PBS以1:1:1加入，每管15 mL分离液，用10 mL移液管，沿管壁缓缓加入上述血液稀释液至45 mL刻度处，切忌分离液液面波动
③室温500 g离心30 min，升降速度分别调至2和0。根据血液中各组成成分密度的不同，离心后，50 mL管内由上而下依次为淡黄色血浆层，单个核细胞白膜层，透明分离液层，及最下方的红细胞层
④用移液管轻轻吸去上层血浆层，并将白膜层转移至新的50 mL管中，同时加入PBS至50 mL，300g离心10min
⑤离心结束后弃上清，弹散管底沉淀，再加入PBS至50 mL，300g离心10 min
⑥离心结束后弃上清，将细胞沉淀弹散。
2. 单核细胞纯化
单核细胞纯化采用单核细胞阳选试剂盒，具体分离方案参考相应说明书。
二、破骨细胞诱导分化
1. 用α-MEM完全培养基(α-MEM培养基+10%FBS40132ES+双抗60162ES)重悬细胞至5×105/mL，加入终浓度为40 ng/mL的Human M-CSF(91103ES)和100ng/ml的Human RANKL(94496ES)
2. 按96孔板（84015ES）每孔加入200 μL细胞悬液，加入完成后，左右上下摇晃96孔板几下，在超净台中静止10 min，待细胞沉降后于倒置显微镜下观察是否铺板均匀，铺板均匀后放入37℃培养箱中培养分化；(若是24孔板84013ES，可加入1.5~2 mL诱导分化)
3. 每3天更换培养基一次，同时补充新鲜的培养液(含40ng/mL的Human M-CSF和100ng/mL的Human RANKL)，诱导分化10天后即可见开始融合的细胞。
注：细胞因子购买后请按照说明书指示溶解并稀释保存，不可反复冻融，诱导分化培养基请根据每次的用量配置，用多少，配置多少。
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重组人RANKL：是驱动破骨细胞终末分化与融合的决定性信号，激活下游NFATc1等关键转录程序
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