中药材也有“DNA身份证”？扩增子测序让伪品无处遁形
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2026-07-31
中药材也有“DNA身份证”？扩增子测序让伪品无处遁形
买过中药材的朋友，有没有遇到过这样的情况——明明买的是“川贝母”，炖了梨喝下去却没啥效果；花大价钱买的“野生黄芪”，泡出来味道总觉得哪里不对？
别怪自己不懂行。有些药材长得实在太像了，连老药工都犯难。川贝母有6个基原物种，长得几乎一模一样；当归和独活晒干之后，肉眼根本分不清谁是谁；更别说那些已经被磨成粉的中成药——打开一包“大黄蛰虫丸”，里面混合了多种药材粉末，传统方法根本没法逐一定性定量。
当归 vs 独活
半夏的五种“替身”
前胡的七个“面孔”
结语
参考文献：
[1] Bi W , Li J , Tang X ,et al.Rapid Screening ofAngelica sinensisRoot Adulteration WithAngelica pubescensRoot in Raw Materials of Chinese Patent Drugs Using Amplicon Sequencing and Gas Chromatography‐Ion Mobility Spectrometry[J].Biomedical Chromatography, 40[2026-07-21].DOI:10.1002/bmc.70454.
[2]孙一帆等. 基于DNA条形码鉴别半夏及其混伪品[J].甘肃中医药大学学报.DOI: 10.16841/j.issn1003-8450.2026.01.06.
[3]吴嘉仪等. 基于ITS2序列及其二级结构的市售前胡药材分子鉴定[J].中国现代中药. Volume 28, Issue 5, 2026, Pages 881-887, ISSN 1673-4890, https://doi.org/10.13313/j.issn.1673-4890.20251202003.
[4]刘震营等。中国市场柏子仁真菌污染调查研究[J].中国中药杂志.2021年01期.
扩增子参考实验步骤
1. 样品收集与准备
样品收集：收集待鉴定的中药材样品，包括单一药材或混合中成药。应根据研究目的采集足够数量的样品（建议每个物种至少5个重复个体）。对于形态学鉴定困难的材料，建议由分类学专家进行基原鉴定。
样品处理：新鲜或干燥的组织样品可采用硅胶干燥保存，以抑制DNA降解；对于含多糖多酚类物质的中药材，需采用专门优化的DNA提取方法；对于颗粒状或丸状中成药，应对样品进行充分研磨。
参考样品：建议同时采集基原植物的凭证标本，保存于标本馆，以备后续溯源和验证。
DNA提取：使用商用试剂盒（如MolPure® Mag Plant DNA Kit（18529ES，植物通用DNA提取）或MolPure® Mag Soil/Stool DNA Kit（18526ES磁珠法土壤/粪便DNA提取试剂盒）），严格按照说明书提取总DNA，并测定DNA浓度和质量（OD260/280在1.8–2.0之间为佳）。
DNA浓度测定：使用qubit定量设备（单通道核酸定量仪80571ES、83509ES，96通道核酸定量仪80575ES、83652ES）搭配qubit试剂（12642ES）测定浓度。
2. 目标片段富集：PCR扩增
（注，不同测序平台，扩增引物会有差异）
设置PCR反应：50 μL PCR体系中包括以下成分：
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组分 |
体积（μL） |
终浓度 |
|
模板DNA |
1 ng -200 ng |
- |
|
正向引物(10 μM)* |
1 |
0.1 μM-0.5 μM |
|
2×Multiplex Long PCR Master Mix（17228ES） |
25 |
|
|
反向引物(10 μM)* |
1 |
|
|
无菌超纯水 |
up to 50 |
- |
配置好以上体系后，在PCR仪中设置以下PCR程序：
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循环步骤 |
温度（℃） |
时间 |
循环数 |
|
热盖 |
105℃ |
On |
- |
|
预变性 |
98℃ |
30 sec |
1 |
|
变性 |
98℃ |
|
30-35（根据实验要求） |
|
退火 |
60℃* |
5 sec |
|
|
退火延伸 |
5~10 sec/Kb |
||
|
终延伸 |
72℃ |
2 min |
1 |
|
暂存 |
4℃ |
- |
- |
3. 扩增产物0.9×纯化
1) 准备工作：将Hieff NGS® DNA Selection Beads（12601ES）磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min，配制80%乙醇。
2) 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。
3) 吸取 45 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）至一轮PCR产物中，室温孵育5 min。
4) 将 PCR 管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约 5 min），小心移除上清。
5) 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育 30 sec后，小心移除上清。
6) 重复步骤5，总计漂洗两次。
7) 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5min）。
8) 直接加入11 μL ddH2O，将PCR 管从磁力架中取出，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。进入下一步反应。
4. 电泳检测
取1 μL PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳（10208ES），确认目标条带明亮清晰，无非特异性扩增。
5.1 选择二代测序时
二次PCR（添加样品标签与测序接头）
二次PCR加标签：以纯化后的一次PCR产物为模板，使用带Illumina或者MGI接头的引物进行二次PCR扩增（13344ES），为每个样品添加独特的index标签，以便混合测序后区分不同样品。
纯化二次PCR产物：再次使用磁珠法纯化加标签后的文库产物（12601ES）。
5.2 选择三代测序时
直接搭配通用建库试剂即可完成三代文库构建（13306ES）。
建库完成后，对文库进行纯化以便后续上机测序（12601ES）。
6. 文库定量、混合与测序
浓度检测：使用qubit定量设备（单通道核酸定量仪80571ES、83509ES，96通道核酸定量仪80575ES、83652ES）搭配qubit试剂（12642ES）测定浓度。
等摩尔混合：将所有样品文库按等摩尔浓度混合，形成最终的测序pool。
高通量测序：将混合文库送检至NGS平台，常用平台包括Illumina NovaSeq、MGI T7或ONT、Cyclone等测序仪。
7. 生物信息学分析
8. 质量控制与验证
n 阳性对照：在测序数据中确认阳性对照物种是否被正确检出，以评估扩增、建库、测序和数据分析流程的可靠性。
n 阴性对照：阴性对照应无任何OTU/ASV检出。若检出超过10条reads，应判定为污染，需重新评估实验操作流程并剔除污染序列。
n 空白试剂对照：在DNA提取和PCR过程中分别设置空白试剂对照，用于识别试剂引入的外源DNA污染。
n 三重重复实验：对于关键样本建议设置3次重复，以评估实验的可重复性和技术变异性。
n ITS2与叶绿体序列交叉验证：对于ITS2难以区分的近缘物种，可采用叶绿体条形码（如psbA-trnH或matK）进行交叉验证，综合多个分子标记的结果做出最终鉴定。
挑战与未来展望
GS技术在DNA宏条形码领域的应用，突破了传统鉴定方法在混合样品分析中的瓶颈，为中草药的质量控制和真伪鉴别提供了强有力的分子工具。然而，该技术在实际推广中仍面临高成本、专业性强、标准化流程缺乏等挑战。当前中国药典已纳入“中药材DNA条形码分子鉴定指南”和“DNA测序技术指南”等规范性文件，表明分子鉴定技术正在从研究领域走向标准化应用。
未来的发展方向包括与AI驱动的数据分析技术深度整合、开发便携式测序设备用于田间快速鉴定，以及将DNA宏条形码与化学指纹图谱等多组学技术相结合，建立正交协同的鉴定体系。这些进展将进一步推动DNA宏条形码技术成为中草药质量控制体系中不可或缺的核心方法。
产品推荐
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实验步骤 |
产品名称 |
产品货号 |
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DNA提取 |
MolPure® Mag Plant DNA Kit |
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MolPure® Mag Soil/Stool DNA Kit磁珠法土壤/粪便DNA提取试剂盒 |
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COI扩增 |
Hieff NGS® Multiplex Long PCR Master Mix/ 长片段多重扩增酶 |
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二代建库 |
2× Ultima HF Amplification Mix |
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Illumina平台接头 |
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MGI平台接头 |
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三代建库 |
Hieff® LongSeq Amplicon End repair and Ligation Module |
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纯化磁珠 |
Hieff NGS® DNA Selection Beads |
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Qubit定量 |
1× dsDNA HS Assay Kit |
