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真菌世界的“身份证”：ITS测序如何解锁微观生命的密钥

真菌感染，尤其是深部真菌感染，向来是临床诊断的“硬骨头”。传统培养方法耗时长、阳性率低，而形态学鉴定又面临不同真菌在显微镜下“长得太像”的尴尬。ITS测序的出现，彻底改变了这一局面。

一项覆盖373株酵母菌（含86个物种）的广泛研究显示，ITS1和ITS2序列分析的正确鉴定率分别高达96.8%和99.7%——这意味着几乎每一份样本都能获得精准的物种级鉴定。在ICU重症肺炎的诊断中，研究人员对比了ITS扩增子测序与标准临床检测方法，结果显示36份样本中仅有1份ITS结果与标准检测不一致，可靠性令人信服。

对于毛霉病这类进展迅速、死亡率极高的感染，早期精准诊断直接关乎患者生死。一项回顾性研究将组织病理学与ITS测序相结合，在14例毛霉病病例中不仅确认了真菌感染，还鉴定出了丰富的系统发育多样性——最常见的为小孢根霉（Rhizopus microsporus，占42.9%） ，其次为伞枝 Lichtheimia（21.4%）。研究证实，组织病理学与ITS测序的联合应用，在实际操作中切实可行，且在检测组织相关感染中的毛霉目真菌方面优于真菌培养。

即使在福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的存档组织样本中，ITS测序仍能有效鉴定丝状真菌，检测率达84.2%至94.7%——这意味着那些尘封在病理科档案柜里的珍贵样本，也能被重新“唤醒”用于回顾性诊断。

纳米孔测序技术的加入更让ITS鉴定实现了“加速度”——一项研究采用ITS和D1-D3纳米孔扩增子宏基因组测序，结果显示测序比传统培养平均快4.92天。从“等几天”到“当天出结果”，ITS测序正在将真菌诊断带入近乎实时的新时代。

真菌是土壤生态系统中不可或缺的分解者、共生者和病原体。然而，传统培养方法能检测到的土壤真菌多样性不足实际存在的1%至5%——绝大多数真菌因无法培养而成为“隐形的居民”。

ITS高通量测序让生态学家第一次系统看清了真菌在全球的分布图景。在湖北省佛手山药主产区，研究者利用真菌ITS技术对不同生产状态下的土壤进行测序，共获得253万余条真菌ITS有效序列，在门水平上确认了12个真菌分类单元，属水平共鉴定到193个真菌物种。研究提示，连作对真菌群落结构的影响可能超过了施药处理——这一发现为农业种植制度的优化提供了科学依据。

在锰矿废弃地，研究者通过ITS测序分析了13种常见植物根际真菌多样性的季节差异，揭示了胁迫环境下植物与根际真菌之间复杂的共生关系。在西藏巴松措，ITS Illumina高通量测序技术被用于明确高原湖泊水体真菌的物种多样性和群落结构。从盐碱地紫花苜蓿根际到南海深海沉积物，从长江口到越南热带沿海——ITS测序正在帮助科学家绘制一幅前所未有的全球真菌“藏宝图”。

食品安全无小事，而真菌污染是食品安全的重大隐患之一。一项针对我国熟制坚果与籽类食品的大规模调查显示，19.32%（560/2912） 的样品霉菌计数超过安全阈值——研究者正是借助ITS测序法对污染霉菌进行了精准的属级鉴定。

在传统发酵食品领域，ITS测序同样大显身手。梧州六堡茶的真菌多样性研究中，ITS高通量测序揭示曲霉属（Aspergillus）和青霉属（Penicillium） 为优势菌群，10个样品全部含有曲霉属，平均相对含量高达86.4%。值得庆幸的是，所有样品的真菌毒素残留量均低于检出限——ITS测序为这款传统名茶的饮用安全提供了科学背书。

农产品安全方面，研究者利用DNA宏条形码技术对酸枣仁、薏苡仁、决明子和苦杏仁4种中药材的污染真菌进行了ITS2高通量测序，结果所有被测样品均受到真菌污染，子囊菌门是最主要的污染菌群。这一发现为中药材的质量控制和储存条件优化敲响了警钟。

在农业领域，ITS序列分析已被广泛用于植物病原真菌的快速鉴定和病害诊断。从万寿菊叶斑病病原菌的分子鉴定到大豆根腐病致病菌的判别，ITS测序为植物病害的早期预警和精准防控提供了可靠的分子依据。一个涵盖近5000个物种、95660条病原真菌ITS序列的病原真菌数据库也已初步建成，覆盖可引发动植物和人类感染的多类重要真菌病原体。

中药材基原混乱一直是困扰质量控制的老大难问题，真菌类药材尤其如此。ITS序列正在成为中药鉴定的可靠“分子身份证”。

研究者运用ITS序列成功鉴别了真菌类药材马勃（Lasiosphaera calvatia）及其混伪品——通过收集来自重庆、北京等9个地方的21份脱皮马勃、大马勃、紫色马勃样品，提取基因组DNA进行PCR扩增和双向测序，实现了精准的物种鉴定。五种保健类中药材表面真菌的ITS2鉴定研究，则为中药材外源污染的真菌来源提供了系统的分析框架。

ITS测序技术本身也在持续进化。传统的Sanger测序只能处理单克隆菌株，而高通量测序让研究者可以一次性解析复杂真菌群落的全貌。纳米孔测序等第三代长读长技术的加入，进一步突破了读长限制，使全长ITS序列的实时测序成为可能。人工智能驱动的生物信息学工具正在为物种识别和耐药性预测提供越来越强大的支持。

从临床活检组织到环境土壤，从发酵食品到中药材表面——ITS测序的应用边界正在不断拓展。它不再只是实验室里的“阳春白雪”，而是正在成为临床微生物室、食品安全检测站、农业病害防控中心和中药材质检机构的标准配置。

如果说16S rRNA测序是打开细菌世界的钥匙，18S rRNA测序是瞭望整个真核宇宙的广角镜，那么ITS测序就是专门为真菌这个庞大而神秘的王国量身定制的“高清显微镜”。从ICU病房里危重患者的精准诊断，到千里之外土壤中隐秘真菌的多样性调查；从餐桌上的坚果零食到药房里的名贵中药材——ITS测序正在以前所未有的精度和广度，重塑我们对真菌世界的认知。这把“分子密钥”已经打开的大门背后，是一个更加精彩、更加复杂的真菌宇宙——而ITS测序，正是我们探索这个宇宙最可靠的向导。

扩增子参考实验步骤

样品收集：收集待鉴定的中药材样品，包括单一药材或混合中成药。应根据研究目的采集足够数量的样品（建议每个物种至少5个重复个体）。对于形态学鉴定困难的材料，建议由分类学专家进行基原鉴定。

样品处理：新鲜或干燥的组织样品可采用硅胶干燥保存，以抑制DNA降解；对于含多糖多酚类物质的中药材，需采用专门优化的DNA提取方法；对于颗粒状或丸状中成药，应对样品进行充分研磨。

参考样品：建议同时采集基原植物的凭证标本，保存于标本馆，以备后续溯源和验证。

DNA提取：使用商用试剂盒（如MolPure® Mag Plant DNA Kit（18529ES，植物通用DNA提取）或MolPure® Mag Soil/Stool DNA Kit（18526ES磁珠法土壤/粪便DNA提取试剂盒）），严格按照说明书提取总DNA，并测定DNA浓度和质量（OD260/280在1.8–2.0之间为佳）。

DNA浓度测定：使用qubit定量设备（单通道核酸定量仪80571ES、83509ES，96通道核酸定量仪80575ES、83652ES）搭配qubit试剂（12642ES）测定浓度。

设置PCR反应：50 μL PCR体系中包括以下成分：

配置好以上体系后，在PCR仪中设置以下PCR程序：

1) 准备工作：将Hieff NGS® DNA Selection Beads（12601ES）磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min，配制80%乙醇。

2) 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3) 吸取 45 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）至一轮PCR产物中，室温孵育5 min。

4) 将 PCR 管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约 5 min），小心移除上清。

5) 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育 30 sec后，小心移除上清。

6) 重复步骤5，总计漂洗两次。

7) 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5min）。

8) 直接加入11 μL ddH2O，将PCR 管从磁力架中取出，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。进入下一步反应。

取1 μL PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳（10208ES），确认目标条带明亮清晰，无非特异性扩增。

二次PCR（添加样品标签与测序接头）

二次PCR加标签：以纯化后的一次PCR产物为模板，使用带Illumina或者MGI接头的引物进行二次PCR扩增（13344ES），为每个样品添加独特的index标签，以便混合测序后区分不同样品。

纯化二次PCR产物：再次使用磁珠法纯化加标签后的文库产物（12601ES）。

直接搭配通用建库试剂即可完成三代文库构建（13306ES）。

建库完成后，对文库进行纯化以便后续上机测序（12601ES）。

浓度检测：使用qubit定量设备（单通道核酸定量仪80571ES、83509ES，96通道核酸定量仪80575ES、83652ES）搭配qubit试剂（12642ES）测定浓度。

等摩尔混合：将所有样品文库按等摩尔浓度混合，形成最终的测序pool。

高通量测序：将混合文库送检至NGS平台，常用平台包括Illumina NovaSeq、MGI T7或ONT、Cyclone等测序仪。

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