流式新手必读：流式细胞染色protocol
3
2026-06-11
一. 实验原理
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）的核心原理是利用流式细胞仪对快速直线流动的单个细胞或颗粒进行多参数、高通量的定量分析及物理分选。当单个细胞逐一通过激光检测区时，仪器会为每个细胞获取三类核心参数：前向散射光（FSC，指示细胞大小）、侧向散射光（SSC，反映细胞颗粒度或复杂度），以及由特定标记（如抗体或染料）发出的荧光信号。
该技术通过荧光标记与激光检测，在单细胞水平同步分析细胞大小、颗粒度、表面抗原表达、细胞周期、细胞凋亡及免疫功能等多项生物学指标，实现不同细胞亚群的精准分型与阳性细胞比例、蛋白表达水平的定量分析。
根据实验目标，对照实验仪器，选择合适指标、荧光。设计多色panel，确定实验方案。
二. 实验对照
为了确保实验的严谨性，建议设置以下对照：
▶️ 阴性/空白对照：调节FSC和SSC电压
▶️ 单染/单阳对照：调节补偿以及各荧光通道电压
▶️ 同型对照：消除背景染色
▶️ FMO对照：确定设门的准确性
▶️ 生物学对照：实验结果对比
三. 细胞表面蛋白染色步骤
1. 样本准备：制备细胞悬液
1.1全血样本
a. 用稀释洗涤液（或1640培养基）将血样稀释2~4倍；
b. 在血液样品中加入3倍体积红细胞裂解液（Cat:40401ES），颠倒混匀，室温放置5 min；
【注】适当增加裂解液的使用量，有利于提高单个核细胞纯度。
c. 室温400 g离心15~30min（最好使用含有缓升缓降功能的离心机），将离心管小心地从离心机中取出，缓缓地吸去最上层，避免接触单个核细胞层；
d. 使用移液器小心的吸取单个核细胞层加入到新的离心管中，加入稀释洗涤液并混匀后，室温下300 g离心10min，小心弃掉上清；
e. 为了去除残余血小板，可将细胞重悬于30~50 mL稀释洗涤液中，室温200 g离心10~15min，小心弃掉上清。
f. 将细胞悬浮于100μL细胞染色buffer（可自行配制：PBS + 0.5% BSA，无菌）中。
1.2组织样本
a. 组织选用合适的解离方法，如研磨（脾脏），酶解离（肝脏），获得细胞悬液。
b. 细胞悬液过70um的滤器（或200目滤网），去除细胞团块；
c. 进行计数，调整细胞浓度至：5X106～1X107/mL。
2. FC受体封闭(选用)
1.1全血样本
单核巨噬细胞、粒细胞、B细胞、树突状细胞等细胞表面表达Fc受体，易与抗体的Fc段非特异性结合，从而影响实验结果。为了减少这种非特异性染色，我们推荐使用Fc受体封闭剂。100μL细胞悬液，加入适量Fc抗体封闭剂，冰上孵育5-10min。
a. 对于mouse样本，推荐使用mouse CD16/32单克隆抗体
b. 对于human样本，推荐使用human Fc受体封闭剂
3. 抗体染色
a. 将前面制备的细胞悬液取100μL加到流式管底，按照说明书的推荐用量加入荧光标记抗体，混匀后置于4℃或室温避光孵育20-30 min。
b. 加入2mL细胞染色buffer重悬细胞，350g离心5min，弃上清。
c. 加入500μL细胞染色buffer重悬细胞。
d.（可选）加入死活染料（传统的DNA结合染料），如PI，加入10 μL，孵育3-5min。
【注】在样本制备的过程中，特别是对于组织样本，常常有大量死亡细胞，会严重影响流式分析结果。所以我们需要使用死活染料来对死细胞进行鉴界定，以减少死细胞对实验结果的干扰。
4. 上机检测
四. 细胞内蛋白染色步骤
1.样本准备：制备细胞悬液（同细胞表面染色步骤）
2.细胞刺激培养
a. 用完全培养基调整细胞浓度为2×106个/mL。
b. 取3-5 mL完全培养基加入无菌培养瓶中，加入细胞、刺激剂和高尔基体阻断剂； 将待测细胞放入37℃、5％ CO2孵箱中培养5h；
c. 收集待测细胞，用PBS洗一次，1000rpm离心5 min，弃上清；
3.表面抗体染色
a. 将前面制备的细胞悬液取100μL加到流式管底，按照说明书的推荐用量加入荧光标记抗体，混匀后置于4℃，室温避光孵育20-30 min；
b. 加入2mL细胞染色buffer重悬细胞，350g 离心5 min，弃上清。
4.固定、破膜
a. 加入500μL预冷(4℃)固定液（Cat: 60536ES），室温避光孵育10 min；
b. 350g离心5～10 min，弃上清；
c. 加入 1.5 mL破膜剂（Cat:40403ES），室温避光孵育 10~15 min；
d. 350g 离心5 min，弃上清。
5、胞内抗体染色
a. 按照实验设计和抗体说明书加入胞内抗体，加破膜剂（Cat:40403ES）至100μL，室温下避光孵育20min；
b. 加入2 mL PBS重悬细胞，350g 离心5分钟，弃上清；
C. 加入500 μL PBS重悬细胞。
6、上机检测
|
亚群 |
抗原 |
产品货号 |
产品名称 |
产品规格 |
|
T Cell (T淋巴细胞) |
CD3 |
32101ES |
Purified Mouse Anti-Human CD3 mAb |
100 μg/1 mg |
|
32102ES |
FITC Mouse Anti-Human CD3 mAb |
25 T/100 T |
||
|
32103ES |
APC Mouse Anti-Human CD3 mAb |
25 T/100 T |
||
|
32104ES |
PE Mouse Anti-Human CD3 mAb |
25 T/100 T |
||
|
CD4 |
32111ES |
Purified Mouse Anti-Human CD4 mAb |
100 μg/1 mg |
|
|
32112ES |
FITC Mouse Anti-Human CD4 mAb |
25 T/100 T |
||
|
32113ES |
APC Mouse Anti-Human CD4 mAb |
25 T/100 T |
||
|
32114ES |
PE Mouse Anti-Human CD4 mAb |
25 T/100 T |
||
|
CD8a |
32121ES |
Purified Mouse Anti-Human CD8a mAb |
100 μg/1 mg |
|
|
32122ES |
FITC Mouse Anti-Human CD8a mAb |
25 T/100 T |
||
|
32123ES |
APC Mouse Anti-Human CD8a mAb |
25 T/100 T |
||
|
32124ES |
PE-Cy5 Mouse Anti-Human CD8a mAb |
25 T/100 T |
||
|
CD28 |
32131ES |
Purified Mouse Anti-Human CD28 mAb |
100 μg/1 mg |
|
|
32132ES |
FITC Mouse Anti-Human CD28 mAb |
25 T/100 T |
||
|
32133ES |
APC Mouse Anti-Human CD28 mAb |
25 T/100 T |
||
|
32134ES |
PE Mouse Anti-Human CD28 mAb |
25 T/100 T |
||
|
B Cell (B淋巴细胞) |
CD3 |
32101ES |
Purified Mouse Anti-Human CD3 mAb |
100 μg/1 mg |
|
32102ES |
FITC Mouse Anti-Human CD3 mAb |
25 T/100 T |
||
|
32103ES |
APC Mouse Anti-Human CD3 mAb |
25 T/100 T |
||
|
32104ES |
PE Mouse Anti-Human CD3 mAb |
25 T/100 T |
||
|
CD19 |
32141ES |
Purified Mouse Anti-Human CD19 mAb |
100 μg/1 mg |
|
|
32142ES |
FITC Mouse Anti-Human CD19 mAb |
25 T/100 T |
||
|
32143ES |
APC Mouse Anti-Human CD19 mAb |
25 T/100 T |
||
|
32144ES |
PE-Cy5 Mouse Anti-Human CD19 mAb |
25 T/100 T |
||
|
CD20 |
32151ES |
Purified Mouse Anti-Human CD20 mAb |
100 μg/1 mg |
|
|
32152ES |
FITC Mouse Anti-Human CD20 mAb |
25 T/100 T |
||
|
32153ES |
APC Mouse Anti-Human CD20 mAb |
25 T/100 T |
||
|
32124ES |
PE Mouse Anti-Human CD20 mAb |
25 T/100 T |
更多产品咨询请点击CD分子流式抗体选购指南。如果您在实验中需要技术上的支持或者遇到产品选择困难问题，欢迎查阅我们整理的Western Blot蛋白免疫印迹(WB)实验操作详解以及免疫组化实验系列详解、免疫荧光全流程解决方案！希望能为您提供一些帮助。
