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肺类器官培养案例 | 人肺类器官培养手册

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2023-01-09

新冠病毒在病变的晚期会大面积感染肺组织，可能会对肺功能造成严重的损害。在过去三年中，人类干细胞衍生的类器官已经成为了新冠研究的有利工具。

人肺类器官(human lung organoid, hLOs)拥有类似支气管和肺泡的结构，与人肺部组织结构功能相似，培养过程复杂。研究人员利用小分子化合物和细胞因子诱导干细胞生成了内胚层，再让内胚层形成三维组织，得到了类似胚胎中早期肺的组织，进一步使其发育成为肺部组织。

人肺类器官培养方案有很多种，接下来，我们根据Han和Alyssa J Miller等文章总结了人类多能干细胞(hPSC)形成人肺类器官和芽尖祖细胞类器官的大致过程^[1][2]。

图1 Alyssa J Miller等的hPSC形成人肺类器官和芽尖祖细胞类器官的过程^[2]

培养方案

hPSC定向分化为内胚层

hPSCs用Accutase (40506ES)处理并接种到低吸附的6孔板上，重悬于含有10 μM Y-27632 (53006ES)、0.5 ng/mL human BMP4 (92053ES)、2.5 ng/mL human bFGF (91330ES)、100 ng/mL human Activin A (91702ES)的无血清分化培养基中培养3-4天。

诱导形成前肠球体

为诱导前肠球体，更换培养基为前肠分化培养基：DMEM/F12（41406ES）培养基中添加1× N-2 (60706ES)、1× B27 (60704ES)、10 mM HEPES (60117ES)、1× L-谷氨酰胺(60314ES)、10 µM SB431542 (53004ES)、200 ng/mL human Noggin (92528ES)、1 µM SAG (53257ES)、500 ng/mL human FGF4 (91303ES)和2 µM CHIR99021 (53003ES)，培养5天。

然后在不破坏单层细胞的情况下收集漂浮的球体，离心后转移至新的离心管中，接种至含有Matrigel胶(40192ES)的平板中，37°C静置。

图2 前肠球体的明场图片^[2]

诱导人肺类器官和芽尖祖类细胞器官

3.1 诱导人肺类器官

向前肠球体中加入人肺类器官诱导培养基：DMEM/F12培养基中添加1× N-2 (60706ES)、1× B27 (60704ES)、1% FBS、10 mM HEPES (60117ES)、1× L-谷氨酰胺(60314ES)、500 ng/mL human FGF10 (91306ES)进行培养，每3-5天更换培养基，每2-3周重新包埋于新鲜Matrigel。

大约需要50天可以产生人肺类器官，并且具有气道样上皮细胞，周围环绕着间充质细胞和表达肺泡细胞型标记物的上皮细胞的弥散网络。

图3 人肺类器官预期生长模式的明场图像^[2]

3.2 诱导芽尖祖细胞类器官

向前肠球体中加入人肺类器官诱导培养基：DMEM/F12培养基中添加1× N-2 (60706ES)、1× B27 (60704ES)、10 mM HEPES (60117ES)、1× L-谷氨酰胺(60314ES)、10 ng/mL human FGF7 (91304ES)、0.5% BSA (36102ES)、50 µg/mL抗坏血酸(53614ES)、3 µM CHIR99021 (53003ES)、50 nM ATRA (53001ES)和0.4 µM monothio-glycerol，进行培养，每2-3天换液，会生成芽尖祖细胞类器官。

培养22天后，芽尖祖细胞类器官含有高度富集和增殖的、转录类似于人类胎儿芽尖祖细胞的SOX2⁺ - SOX9⁺ ID2⁺NKX2.1⁺种群细胞。

图4 芽尖祖细胞类器官生长模式的明场图像^[2]

相关产品

产品名称	产品编号	规格	简介
Y-27632	53006ES	1 mg/5 mg/10 mg	ROCK抑制剂
SB431542	53004ES	5 mg/10 mg/50 mg	Src家族激酶抑制剂，TGF-β信号通路抑制剂
IWP2	53013ES	5 mg/10 mg/50 mg	Wnt抑制剂
CHIR99021	53003ES	2 mg/5 mg/10 mg	GSK-3α/β抑制剂
Smoothened Agonist (SAG)	53257ES	2 mg/5 mg/10 mg	Smo受体激动剂
Dexamethasone 地塞米松	40323ES	1 mL/25 mg/100 mg	糖皮质激素受体
L-Ascorbic acid L-抗坏血酸	53614ES	1 g/5 g	维生素C，抗氧化剂
Retinoic acid（维甲酸，维A酸）	53001ES	100 mg/500 mg/1 g	诱导细胞分化
1-Thioglycerol	60729ES	5 g/10 g/50 g	抗氧化，支持细胞增殖
IBMX	53285E	50 mg/100 mg/250 mg	PDE抑制剂
Accutase™ 细胞消化液	40506ES	100 mL	细胞消化液
human BMP4	92053ES	10 μg/100 μg/500 μg	重组蛋白
human bFGF	91330ES	10 μg/100 μg/500 μg	重组蛋白
human Activin A	91702ES	10 μg/100 μg/500 μg	重组蛋白
human Noggin	92528ES	5 μg/100 μg/500 μg	重组蛋白
human FGF4	91303ES	5 μg/100 μg/500 μg	重组蛋白
human FGF10	91306ES	5 μg/100 μg/500 μg	重组蛋白
human FGF7	91304ES	10 μg/100 μg/500 μg	重组蛋白
N-2 supplement,serum free,100X	60706ES	5 mL	用于细胞和组织体外培养
L-Alanyl-L-Glutamine L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（等同于GlutaMAX添加剂）	60701ES	100 mL	提供稳定性谷氨酰胺
Ceturegel® Matrix for Organoid culture，Phenol Red-Free，LDEV-Free Plus 基质胶	40192ES	1.5mL/5mL/10mL	类器官专用培养基
HEPES溶液(1 M)，细胞培养级	60117ES	100 mL	化学缓冲剂
L-谷氨酰胺	60314ES	100 g	氨基酸
BSA牛血清白蛋白,诊断级别	36102ES	25 g/100 g/500 g/1 kg	用于细胞培养
50× B-27无血清添加剂，去除维生素A	60704ES	10 mL	无血清添加剂