干细胞&小分子化合物 | 角膜缘干细胞体外培养与扩增案例
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2026-06-10
—— 靶向调控ROCK、Wnt/β-catenin信号通路实现角膜缘干细胞体外扩增与干性维持
一、研究背景
全球超千万人受角膜缘干细胞缺乏症（LSCD）困扰，角膜盲是全球第二大致盲性眼病。终末期患者依赖异体角膜移植，但面临供体短缺、免疫排斥等临床困境。角膜缘干细胞（LSCs）是角膜上皮修复与再生的核心种子细胞，但原代细胞体外易衰老、易分化、克隆形成率低，难以规模化制备。
以Y-27632（ROCK抑制剂）与LiCl（Wnt激活剂）为核心的小分子组合，可精准调控 LSCs 增殖与干性，无需基因操作，是解决上述问题的关键方案。
二、核心研究发现
Y-27632 可在饲养层共培养体系下，使原代角质形成细胞（含角膜缘上皮细胞）突破复制性衰老，实现长期稳定增殖，形态维持早期上皮细胞特征。
Wnt/β-catenin 信号特异性富集于人角膜缘区域，激活该信号可显著提升 LSCs 克隆形成效率与增殖能力，并维持干细胞未分化表型。
LiCl 激活 Wnt 信号后，LSCs 克隆形成效率提升1.7 倍，总细胞数提升1.4 倍，干性标志物ΔNp63α上调，分化标志物CK12下调。
长期 Y-27632 处理的细胞保持正常核型、完整 DNA 损伤应答能力，移除小分子后仍可分化形成复层上皮。
三、核心产品性质
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特性 |
核心诱导小分子描述 |
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核心功能组分 |
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核心作用 |
促进角膜缘干细胞增殖、提升克隆形成率、维持干性、延缓衰老 |
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适用场景 |
人原代角膜缘干细胞分离、体外扩增、克隆形成能力检测 |
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产品纯度 |
≥98% |
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储存条件 |
-20℃避光冻存，性能稳定，批次间差异小 |
核心组分关键参数
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产品名称 |
CAS 号 |
分子式 / 分子量 |
永利3044集团官网货号 |
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146986-50-7 |
C14H21N3O / 247.34 g/mol |
53006ES |
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7447-41-8 |
LiCl / 42.39 g/mol |
718666ES |
四、实验方案
4.1 细胞培养与角膜缘干细胞定向扩增 +
实验步骤（来自 IOVS 2011 + JCI 2010）
1) 饲养层细胞制备：3T3-J2细胞经丝裂霉素C处理，制成灭活饲养层。
2) 角膜缘组织消化：Dispase II （Cat#40104ES）37℃消化2小时，分离上皮层；胰酶（Cat#40127ES）消化为单细胞。
3) 细胞接种：以 1×10⁴ cells/cm² 接种于饲养层，使用 F 培养基 / KSFM 培养基。
4) 小分子处理：添加10 μM Y-27632 或 500 μM 氯化锂（LiCl），每2–3天换液。
5) 传代：细胞达80%汇合度以1:10–1:20传代。
实验结果
- Y-27632 处理组细胞增殖速率显著提升，形态小而均一，无衰老扁平细胞。
- LiCl 处理组细胞克隆更大、更多，Ki67 阳性增殖细胞比例显著升高。
- 扩增细胞高表达 ΔNp63α、ABCG2，低表达 CK12。
图1 人角膜缘与中央角膜 Wnt 通路表达与 β-catenin 定位注：(A) 角膜缘特异性高表达 Wnt2/6/11/16b 及抑制剂；(B) RT-PCR 验证 Wnt 家族表达；(C,D)β-catenin 仅在角膜缘基底细胞出现核定位；(E–H) Wnt2、Wnt16 在角膜缘特异性表达
图2 LiCl 激活 Wnt/β-catenin 促进 LSCs 克隆形成与增殖注：(A,B)β-catenin 核转位；(C,D) 克隆形态对比；(E) 克隆形成效率提升 1.7 倍；(F) 总细胞数提升 1.4 倍
图3 LiCl 提升 LSCs 增殖活性注：(A,B) Ki67 免疫荧光；(C) Ki67 mRNA 水平显著上调
图4 Wnt 激活维持 LSCs 干性表型注：(A–F) 干性标志物 ABCG2、ΔNp63α 与分化标志物 CK12 染色；(G)ΔNp63α 上调、CK12 下调。
4.2 角膜缘干细胞全克隆形成能力验证实验 +
实验步骤
1) 单细胞低密度接种（1000 cells / 孔）。
2) 培养 14 天，对照组与 LiCl/Y-27632 处理组对比。
3) 罗丹明 B 染色，计数全克隆、部分克隆、旁克隆。
4) 计算克隆形成效率（CFE）。
实验结果
- LiCl 使 CFE 提升 1.7 倍。
- Y-27632 显著提升全克隆（holoclone）比例。
- 全克隆高表达干性标志物。
图5 Y-27632 显著延长角质形成细胞体外增殖寿命注：HFK、HCK、HVK 三种细胞在 Y-27632 作用下突破衰老，持续增殖
图6 Y-27632 处理细胞维持早期上皮形态注：左：早期传代；中：对照组衰老细胞；右：Y-27632 长期处理仍保持均一小细胞形态。
4.3 体外长期扩增与永生化相关验证实验 +
实验步骤
1) 长期传代培养，记录群体倍增数。
2) 核型分析（G显带）。
3) qPCR检测TERT、端粒长度。
4) Western blot 检测 p53、p21、MYC、p16。
5) 气液界面培养评估分化能力。
实验结果
- Y-27632组可连续传代超150代，对照组20–40代即衰老。
- 长期传代后核型正常。
- TERT表达上调，端粒长度缩短后稳定。
- 保留完整p53-DNA损伤应答通路。
- 可形成结构正常的复层上皮。
图7 Y-27632 上调 TERT 并稳定端粒长度注：(A) TERT mRNA 随传代升高；(B) 端粒长度缩短后趋于稳定
图8 Y-27632 处理细胞保留正常 DNA 损伤应答注：(A) MYC、p16 表达；(B) 放线菌素 D 诱导后 p53/p21 正常上调
图9 长期 Y-27632 处理细胞仍可形成复层上皮注：(A) 原代早期细胞；(B) Y-27632 处理 18 代细胞，气液界面培养形成完整上皮
图10 分化标志物分层表达正常注：K14（基底层）、Involucrin（棘层）、Filaggrin（颗粒层）表达模式正常
五、作用机制总结
- Y-27632 抑制 ROCK → 减少凋亡、延缓衰老、提升克隆形成、延长体外寿命。
- LiCl 激活 Wnt/β-catenin → 促进增殖、提高克隆效率、维持干性、抑制分化。
- 饲养层共培养是 Y-27632 实现长期扩增的必要条件。
- 小分子仅调控增殖与干性，不破坏基因组稳定性与分化潜能。
六、研究主要结论
- Y-27632 可显著延长人原代上皮细胞体外增殖寿命，形态与核型保持正常。
- Wnt/β-catenin 信号是调控人角膜缘干细胞增殖与干性的重要通路。
- LiCl 可安全高效提升 LSCs 克隆形成与增殖，同时维持干细胞表型。
- 小分子体系无需基因操作，可用于角膜缘干细胞体外标准化扩增。
七、产品汇总
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产品名称 |
产品货号 |
规格 |
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Y-27632 (ROCK 抑制剂) |
53006ES |
1 mg/5 mg/10 mg/50 mg/100 mg |
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718666ES |
25 g |
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40127ES |
100 mL |
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40104ES |
100 mg/1 g |
参考文献
[1] Chapman S, Liu X, Meyers C, et al. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. Journal of Clinical Investigation, 2010, 120(7): 2619-2626. https://doi.org/10.1172/JCI42297
[2] Nakatsu MN, Ding Z, Ng MY, et al. Wnt/β-Catenin Signaling Regulates Proliferation of Human Cornea Epithelial Stem/Progenitor Cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2011, 52(7): 4734-4741. https://doi.org/10.1167/iovs.10-6486
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