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干货分享 | 当细胞凋亡检测遇到假阳性，该怎么办？

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2021-01-05

Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒是用FITC标记的Annexin V作为探针，来检测细胞早期凋亡的发生，是细胞凋亡检测实验中最常用的一种探针组合。

[ 检测原理 ]

在细胞凋亡早期阶段，细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）从胞质转至胞外，暴露在细胞外环境中，细胞膜通透性增加，从而被PS特异的Annexin-V探针标记。

Annexin-V为Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，对PS有极强的结合力。PI是一种经济、稳定的核酸染料，它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但可以透过凋亡晚期和坏死细胞的细胞膜而使细胞核染红。

将Annexin V与PI联合使用时，PI被排除在活细胞和早期凋亡细胞之外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被FITC和PI结合染色呈现双阳性。

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图1. Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测原理

流式细胞仪分析：

FITC最大激发波长为488 nm，最大发射波长525 nm，FITC的绿色荧光在FL1通道检测；

PI-DNA复合物的最大激发波长为535 nm，最大发射波长为615 nm，PI的红色荧光在FL2或FL3通道检测。

图2. Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测结果

在凋亡实验中，经常会出现假阳性或与预期结果不符的情况，可能的原因有补偿调节不当、细胞浓度过高、消化过度、药物干扰、药物处理时间过长、样本自身问题等多个方面，接下来，小翌就带您一起看看该如何得到一张完美的结果图。

补偿调节不当

荧光素被激光激发后发出不同波长的荧光，理论上每一种荧光通过选择恰当的滤光片可被相应的检测器检测到，而不受其他荧光的干扰。但目前这些荧光染料都具有宽发射谱性质，尽管它们的发射峰各不相同，但发射谱范围有一定的重叠^【1】，也就是说，相邻的检测器会检测到彼此的荧光信号，这样就影响了检测结果的准确性，因此，多色分析时必须进行光谱重叠的校正。^【2】

图3. FITC和PI的发射光谱

调节方法：设置对照

空白管：诱导凋亡的细胞不加染料，用来调节荧光通道的光电倍增管电压；

单染管：分别需要只加PI和荧光标记的Annexin V两个单染管，用来调节2个荧光通道的补偿值；

荧光素之间的补偿值应保持恒定；双荧光染色时，如果一个荧光很强，而另一个很弱，则一定要做补偿；补偿只应用在同一个激光激发的不同荧光素之间，避免补偿不足和过度补偿。^【3】

细胞浓度过高

细胞浓度过高，培养基消耗过快，导致细胞饥饿发生凋亡。因此在做细胞凋亡处理前，应尽量使细胞处在最佳状态，再进行细胞凋亡诱导处理，避免细胞本身的衰老引起的凋亡。

图4. 细胞浓度过高导致细胞自发凋亡，空白对照（左），实验组(右)

细胞消化过度

对贴壁细胞，消化是最关键的步骤，消化液需用不含EDTA的胰酶，因为Annexin V和PS的结合需要Ca²⁺，而EDTA是Ca²⁺ 螯合剂，使用含有EDTA的胰酶会造成假阴性。细消化时可以将胰酶铺满孔板底后，轻摇使胰酶与细胞充分接触，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余少量胰酶再消化一段时间，待细胞间空隙增大，瓶底呈花斑状即可终止，吹打细胞要轻柔，过度消化和机械损伤都会引起细胞膜的损伤，造成假阳性。

图5. 细胞消化过度导致早期凋亡细胞占89.15%

诱导凋亡的药物带来荧光干扰

下图中可以看出，未经处理的空白对照组（左）早期凋亡占3.38%，晚期凋亡细胞占6.64%，而右图中Q1和Q2中的细胞占90%，几乎所有细胞都在PI通道产生荧光，判断是药物带来的荧光干扰。因此，在选择试剂盒时，应尽量避开药物和细胞自带的荧光信号。

图6. 药物自身的荧光干扰：空白对照（左）和经过药物处理的细胞（右）

样品放置过久或药物处理时间过长

样品处理完毕后应进快进行流式检测。样品处理时间过长，也容易导致细胞进入晚期凋亡和坏死阶段，如下图，空白对照组结果正常，但是药物处理组出现大量凋亡晚期细胞，考虑是药物处理时间过长导致。

图7. 药物处理时间过长：空白对照（左）和经过药物处理的细胞（右）

检测样本是神经细胞

（1）检测样本是神经细胞

神经细胞膜容易破坏外翻，导致假阳性，所以Annexin V/PI 双染法流式检测细胞凋亡不适用于神经细胞。

（2）检测样本来源于血液

如果样品来源于血液，请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS，能与Annexin V结合，从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA的缓冲剂并在200 g离心洗去血小板。

参考文献：

【1】Pietkiewicz S , Schmidt J H , Lavrik I N . Quantification of apoptosis and necroptosis at the single cell level by a combination of Imaging Flow Cytometry with classical Annexin V/propidium iodide staining[J]. Journal of Immunological Methods, 2015, 423:99-103.

【2】陈军浩, 刘勇, 邹征云,等. 流式细胞术Annexin V/PI检测细胞凋亡阳性界线值及补偿值的确定[J]. 现代检验医学杂志, 2008(04):24-27.

【3】王辉, 高颖. 应用流式细胞仪的常见问题及解决对策[J]. 现代仪器与医疗, 2012(01):64-65.

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