类器官培养常见问题
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2026-04-16
类器官作为高度模拟体内器官结构与功能的3D细胞模型，已成为发育生物学、疾病建模、药物筛选、精准医疗等领域的核心研究工具，其培养质量直接决定实验的科学性与重复性。本文系统梳理类器官培养全流程的高频问题，提供可直接落地的解决方案。
1.基质胶在类器官中的作用？
基质胶是目前最常用、最成熟的类器官三维支架。它能提供必要的化学信号（细胞因子）和结构性细胞外基质蛋白，模拟体内三维微环境。
2.类器官按照起始细胞的类型，分为几种？
常见类器官根据起始细胞类型，分为两种：
（1）肿瘤组织来源的肿瘤类器官；
（2）干细胞来源的类器官，包括：多能性干细胞 (PSC)，成体干细胞 (ASC)。
3.类器官培养和普通细胞培养有何不同之处？
（1）细胞培养方式不同：类器官需要借助基质胶等支撑物来维持其三维结构，而普通细胞培养则不需要；
（2）类器官的培养需要实现体外分化和自组装，因此需要使用多种细胞因子的组合诱导，所需培养基成分相对复杂。而普通细胞培养通常只涉及单一类型的细胞，所以培养基成分相对简单；
（3）细胞来源不同：类器官通常来源于成体干细胞 、多能干细胞或肿瘤组织，而普通细胞培养适用于培养多种类型人为筛选细胞。
4.在没有新鲜组织的情况下，可以用冻存组织进行3D培养吗？
可以的。文献有报道可以将冻存组织进行2D或者3D培养。由于组织来源不同、冻存条件不同，还需要根据实际情况验证。
5.类器官可以传代，冻存和复苏吗？
传代时既可采用小细胞团块形式传代，也可通过机械分离或无酶传代试剂制备成单细胞悬液进行传代，根据类器官类型及汇合度，通常按1:3～1:4比例传代。冻存方面，多数类器官（尤其是患者来源类器官 PDOs）均可稳定冻存，仅少数成熟的 iPSC衍生类器官（如肺类器官）冻存难度较高。冻存时取生长状态良好的类器官，收集足量细胞（如1～2个6孔板孔位），使用含ROCK抑制剂的冻存液，经程序降温后转移至液氮保存。
6.类器官可以进行多少次传代？
类器官的传代通常是根据培养时间判断。一般在7-14天时进行第一次传代，后续则每7-10天传代一次。大部分类器官可以在体外连续传代10次（>6个月）。
7.类器官传代怎么消化？
建议使用类器官专用消化液，消化时间需根据类器官类型和大小优化（通常为2～10 min不等），以镜下观察类器官解离为小细胞团块或单细胞为准。
8.样本肿瘤组织偏小，培养的类器官数目不足以进行后续检测，怎么办？
手术组织所需的原始肿瘤组织大小通常应大于2-3颗黄豆大小；若使用穿刺活检方式获取样本，则至少需要2-3条穿刺样本，而内镜活检需要至少钳取6颗以上肿瘤组织。由于肿瘤来源的类器官在传代后可能会出现表型上的差异，一般推荐控制在2-3代内用于实验，最多不超过5代。如果细胞数目太少，经过5代的传代仍然无法满足测试需求，可以考虑改变检测方式，例如将96孔板换成更小的384孔板，甚至尝试使用微流控芯片等更小的体系进行测试。
9.类器官培养过程中发现有黑色小颗粒，如何去除？
黑色小颗粒大概率是杂质或细胞碎片，可将类器官消化下来，用培养基进行反复清洗，达到稀释杂质的作用；用无菌手术刀将类器官切成两半，取1mL注射器吸满培养基并轻轻推出，冲洗类器官中的杂质。
10.鉴定类器官的方法有哪些？
初步可以通过显微镜和H&E染色观察形态；然后可以用Western Blot、qRT-PCR、免疫荧光、流式细胞术检测该类器官是否表达相应的biomarker；基因测序可以鉴定所培养的类器官是否有某些特征丢失；对于部分类器官，还可以检测其是否具有功能，例如心脏类器官可以自主跳动。
11.获取临床样本，如何避免污染？
（1）取材时尽量保证无菌取材；
（2）提取前可以用含双抗的pbs浸泡几分钟：常见与外界环境有接触可能的胃、肠、膀胱等位置肿瘤建议用含3%-5%双抗的pbs浸泡5-10min，其他常见肿瘤用含1%-2%双抗的pbs浸泡5min左右；
（3）提取细胞过程中所用试剂均加1%双抗及合适浓度的原代抗生素。
12. 在培养过程中，PDO生长情况与之前相比异常，主要表现为生长周期变短，增殖迅速，这是什么原因？
（1）可能是由某些杂质细胞（如成纤维细胞）的大量生长引起的。在这种情况下，建议进行切片染色并观察，以确定是否存在这些细胞的污染再进一步去除；
（2）培养基条件改变，某些因子或小分子的加入可以进一步激活PDO的增殖通路。
（3）可能伴随细胞群体优势克隆扩增、基因表达改变或基因突变，建议与初代PDO测序比对。这种变化往往不可避免，在长期传代中应定期冻存早期代次，并控制实验在稳定代次内完成。
13.类器官培养到什么时候可以加药？
一般建议是长到200-300um可以加药，传代至第2代或者第3代开始药敏试验。
14.在类器官回收时，会有不少类器官粘附在离心管壁，如何提高回收率？
收集后离心时用水平转子离心机，可以适当提高一点离心机转速。
15.按照文献方法进行类器官培养，观察到类器官的形态与文献有差异，是什么原因？
首先，不同个体样本来源差异和分型不同且存在异质性；其次，选用的细胞因子及小分子抑制剂的品质是否有差异都有可能导致不同类器官分化形态。建议通过HE，IHC，基因测序等方法与源组织确定类器官形态与源组织是否具有一致性，并不一定局限于文献形态。
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类型 |
货号 |
产品名称 |
应用方向 |
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基本浓度 |
40183ES |
皮下成瘤、细胞迁移/侵袭 |
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40184ES |
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高浓度 |
40187ES |
主要应用于体内成瘤实验（较难成的细胞系） |
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40189ES |
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40188ES |
CeturegelTM Matrix High Concentration，Phenol Red-Free，LDEV-Free 基质胶 |
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低生长因子 |
40185ES |
主要用于血管生成实验 |
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40186ES |
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干细胞专用 |
40190ES |
主要用于如hESC，iPSC等干细胞培养 |
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类器官专用 |
40191ES |
CeturegelTM Matrix for Organoid culture，Phenol Red-Free，LDEV-Free 基质胶 |
类器官培养专用基质胶 |
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40192ES |
CeturegelTM Matrix for Organoid culture，Phenol Red-Free，LDEV-Free Plus 基质胶 |
类器官培养专用基质胶升级款，适配更多组织样本 |
