永利3044(中国集团)有限公司官网

L929是一种小鼠成纤维细胞系，分泌巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，这是造血干细胞分化为BMDMs所必需的。因此，L929细胞条件培养基用于分化BMDMs（见BMDM分化步骤）。

①在37℃和5% CO2条件下，将L929细胞培养在含有DMEM完全培养基的10 cm细胞培养皿（Cat#84003ES）中。当细胞丰度达到约80%时，用新鲜的DMEM完全培养基进行替换。

注意：如果最初以20%细胞丰度接种，通常需要3天达到80%细胞丰度。

表1 DMEM完全培养基
试剂	终浓度	500 mL用量	货号
FBS	10%	50 mL	40132ES
青霉素-链霉素双抗	1%	5 mL	60162ES
DMEM	/	补足至500 mL	41401ES
于4℃保存，最长1个月

②三天后，收集培养基，使用通过0.22 μm过滤器（Cat#84309ES）过滤。过滤后的条件培养基可以分装并储存在-80℃。

注意：此时可能会发生一些细胞死亡，但死细胞不会影响条件培养基的质量。所有细胞和细胞碎片都将通过过滤去除。此时条件培养基呈微黄色。

条件培养基中M-CSF的浓度对于后续步骤中BMDMs的成功分化至关重要。因此，建议通过预实验测试每批条件培养基支持BMDM分化的质量。

L929条件培养基可以用重组M-CSF（Cat#91109ES）替代。

①使用CO2装置安乐死小鼠，随后进行颈椎脱臼。

②用镊子和剪刀去除骨骼上的皮肤及骨骼肌组织，并在10 cm培养皿中用冷PBS（Cat#41404ES）洗涤骨骼。

a. 将骨骼放入含PBS的新10 cm培养皿中，在膝关节处剪断，分离股骨和胫骨。

b. 去除残留组织，并在新培养皿中再次用PBS洗涤。

注意：须彻底清除骨骼上的骨骼肌，以避免组织细胞污染。

③ 用含2% FBS的冷PBS灌满3 mL注射器。

a. 剪去骨骼两端，轻柔地将连接28号针头的注射器插入骨髓腔，推动PBS溶液，冲洗骨髓并将其收集于空的10 cm培养皿中。

b. 用PBS/FBS溶液重新灌满注射器，重复该步骤，直至所有骨髓组织均被冲洗至培养皿中。

注意：PBS/FBS溶液需在每次骨髓分离前新鲜配制。

当骨髓被完全冲洗后，骨的颜色由深红色变为白色（见图 1A）。

所获得的骨髓细胞数量取决于小鼠的年龄与遗传背景。通常以6–8周龄小鼠作为理想的骨髓供体。

④用5 mL移液管（Cat#84503ES）轻柔地上下吹打 PBS/FBS/骨髓混合物数次，以充分分散骨髓组织。然后将溶液转移至15 mL离心管（Cat#83505ES）中，继续上下吹打数次。将离心管置于冰上。

⑤裂解红细胞。

a. 离心机（1400 rpm）在25℃下离心5分钟，以沉淀细胞。

b. 吸取上清液。加入5 mL红细胞裂解液（Cat#40401ES）和1 mL FBS。重悬细胞，并在室温下孵育5分钟裂解红细胞。

注意：红细胞裂解缓冲液对骨髓细胞有毒性。加入FBS可降低细胞毒性并提高细胞活性。

⑥用冷PBS清洗细胞。

a. 1400 rpm离心5分钟（4℃）沉淀细胞。

b. 将细胞重悬于10 mL冷PBS中，再次离心（1400 rpm）5分钟沉淀细胞。

c. 重复清洗两次。

⑦将细胞重悬于1 mL预热至37℃的RPMI 1640完全培养基中。随后加入含有6 mL预热RPMI 1640完全培养基（表2）的10 cm细胞培养皿。

表2 RPMI 1640完全培养基
试剂	终浓度	500 mL用量	货号
FBS	10%	50 mL	40132ES
青霉素-链霉素双抗	1%	5 mL	60162ES
RPMI 1640	/	补足至500 mL	41402ES
于4℃保存，最长1个月

⑧在37℃和5% CO2下孵育5小时去除基质细胞。

注意：5小时后，基质细胞会附着在培养皿表面，而骨髓干细胞和前体细胞保持未附着或悬浮状态（图 1B）。

关键： 此步骤对于去除基质细胞是必需的，如果允许其生长，它们会附着在培养皿上并与分化的BMDMs混合无法区分。此步骤对于BMDMs的纯度至关重要。

⑨5小时后，小心收集含有未附着细胞的培养基至 15 mL离心管中。注意不要扰动附着的细胞。

a. 1400 rpm离心5分钟（4℃）沉淀细胞，并将细胞重悬于1 mL RPMI 1640完全培养基中。

b. 使用血球计数板（Cat#84107ES）计数细胞数量

 

图 1. 骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）的制备

(A) 小鼠长骨在骨髓冲洗前后的状态对比。(B) 几个关键时间点的代表性细胞图像。

在此方案中，我们在BM细胞分化为BMDMs之前使用慢病毒介导的DNA转移来修饰 BM 细胞 (Miller and Blystone, 2015)。在我们的实验中，我们用携带SOCS1 cDNA的慢病毒（SOCS1-慢病毒）转导BM细胞，使用GFP-慢病毒作为对照 (Du et al., 2020)。我们发现，转导BM前体细胞比直接转导完全分化的BMDMs更能有效地将基因递送到BMDMs中。

①将1 mL BM细胞（最多2x106个细胞）加入到含有6 mL RPMI 1640完全培养基的新10 cm细胞培养皿中。

注意：通常从小鼠身上可以获得1-5 x 106个骨髓细胞，具体取决于小鼠的年龄和大小。

②解冻慢病毒储备液。向慢病毒溶液（0.1-0.2 mL）中加入Polybrene（Cat#40804ES）至终浓度为6 μg/mL。在25℃下孵育5分钟。

关键：Polybrene对于提高慢病毒转导效率是必需的。基本原理是Polybrene可以中和细胞表面和病毒颗粒之间的电荷排斥。

③将慢病毒-Polybrene复合物以10的感染复数 (M.O.I.) 加入培养皿中的BM细胞。在 37℃和5% CO2下孵育细胞48小时。

除慢病毒转导以外还可以通过细胞转染的方式进行：转染试剂选购指南

使用分化培养基（表3）将转导的BM细胞分化为 BMDMs。

表3. BMDM分化培养基
试剂	终浓度	500 mL用量
RPMI 1640完全培养基	70%	350 mL
L929 条件培养基	30%	150 mL
于4℃保存，最长1个月

①培养48小时后，小心吸出含有慢病毒的培养基，并替换为分化培养基。

注意：此时大多数BM细胞已附着在培养板上。

②在37℃和5% CO2下继续培养7天。每2天更换一次新鲜的分化培养基。

注意：7天后，培养细胞（BMDMs）的形状显得更长且更像椭圆形（图 1B）。

转导的BMDMs呈GFP阳性。可以通过在荧光显微镜下观察细胞来估计转导效率。可以通过Western blot评估递送基因（如 SOCS1）的表达。WB实验指南详见：Western Blot蛋白免疫印迹(WB)实验操作详解

为了清除巨噬细胞，需要将含氯膦酸盐的脂质体（Cat#40337ES）静脉注射到小鼠体内。我们通过眼眶后静脉窦注射这些脂质体(Yardeni et al., 2011)。

①注射前两小时，取出氯膦酸盐脂质体（Cat#40337ES）和对照脂质体（Cat#40338ES），使其平衡至室温。

注意：氯膦酸盐脂质体和PBS脂质体（对照脂质体）储存在4℃，不可冻存。

②颠倒脂质体管几次（8-10次），直到液体变得均匀。

③使用带有28号针头的1 mL注射器吸取0.2 mL氯膦酸盐脂质体或对照脂质体。

关键：注射小鼠前务必去除任何气泡。将空气注入静脉可能导致死亡。

④在II级B2型生物安全柜中使用精密蒸发器用异氟烷麻醉小鼠。

a. 将小鼠放入腔室并紧紧盖上盖子。

b. 将氧气流量计和异氟烷蒸发器设置分别调整为1 L和0.05-4%。

c. 等待小鼠进入深度昏迷状态，然后将其从腔室中取出。可以通过足部反射消失来确认完全麻醉。

注意：当小鼠侧卧时呼吸会变得有节奏，证明小鼠处于适当麻醉状态。不要让小鼠过度暴露于异氟烷，过度暴露可能导致小鼠死亡。由于麻醉的小鼠可能在15秒内醒来，注射应在6-7秒内完成。

⑤注射前立即通过颠倒含有脂质体的注射器6-8次来重悬脂质体溶液，使脂质体液体均匀。

⑥缓慢将0.2 mL脂质体注射到眼眶后窦中。

a. 注射时，将麻醉的小鼠侧放，拉开眼睛上方和下方的皮肤，使眼睛略微突出。

b. 在眼底，将针头在内眦处以约30°角插入眼眶后窦（见图2）。有关眼眶后注射的更多详细信息，请参阅参考文献 (Yardeni et al., 2011)。

注意：如果针头插入正确位置，应该感觉不到阻力，注射后出血很少或不出血。脂质体溶液也可以从尾静脉注射或腹腔注射。巨噬细胞清除剂实验操作指南

⑦注射完成后，将小鼠放回笼中。

注意：需观察小鼠，确保其完全从麻醉中恢复后方可离开。小鼠通常需要15-20秒恢复。

图2.使用1 mL注射器进行小鼠眼眶后注射

注射脂质体48小时后，可以通过使用荧光激活细胞分选 (FACS) 分析脾脏中的F4/80+常驻巨噬细胞来确认巨噬细胞的消除。需要此验证步骤来建立实验条件。一旦建立了最佳实验条件，此步骤并不总是必要的。

①注射脂质体48小时后，使用CO2室安乐死小鼠，随后进行颈椎脱臼。

a. 立即用70%乙醇消毒皮肤，用手术剪打开腹腔并采集脾脏。

b. 将脾脏放入装满含有10% FBS的冷RPMI1640的10 cm培养皿中。

②将脾脏放在70 μm细胞筛（Cat#84702ES）上，使用1 mL注射器的末端将脾脏捣碎穿过细胞筛。将过滤后的细胞悬液收集到15 mL管中。

a. 离心细胞（1400 rpm，5分钟，4℃）。将细胞重悬于5 mL红细胞裂解缓冲液中，并在25℃下孵育5分钟以裂解红细胞。

b. 加入10 mL冷PBS。离心（1400 rpm，5分钟）收集细胞。

c. 通过重复此步骤再次用冷PBS清洗细胞。将细胞保持在冰上。

③FACS分析。

a. 将细胞在0.1 mL Live and Dead Violet Viability 溶液中于冰上孵育30分钟。用冷 PBS 清洗细胞一次并离心（1400 rpm，5分钟，4℃）。可用Calcein-AM/PI 活细胞/死细胞双染试剂盒代替（Cat#40747ES）

b. 用抗小鼠MHCII FITC（1:200稀释）（Cat#771591ES）和抗小鼠F4/80 APC（1:200稀释）（Cat#32252ES）在黑暗中于冰上染色细胞30分钟。用冷PBS清洗细胞一次。

c. 使用BD LSRFortessa仪器进行FACS分析。

d. 使用FlowJo软件(V10)分析FACS数据（图3）。

注意：通常在注射一次氯膦酸盐脂质体48小时后，可以观察到常驻巨噬细胞的成功清除（减少>90%）。图3显示了在48小时后注射一剂或两剂氯膦酸盐脂质体后脾脏巨噬细胞清除的示例 (Du et al., 2020)。 

图3. FACS验证巨噬细胞清除

（A）小鼠脾脏巨噬细胞在用对照脂质体、一次或两次氯膦酸酯脂质体处理后48小时的代表性FACS分析图。

***p<0.001，单因素方差分析。

（B）FACS分析的定量数据（数据引自doi:10.1016/j.devcel.2020.10.023）。

氯膦酸盐脂质体处理两天后，可以用新的巨噬细胞重建巨噬细胞清除后的小鼠。在此方案中，我们使用了慢病毒转导的BMDMs。这些BMDMs通过眼眶后静脉窦静脉注射递送至小鼠体内。由于内源性巨噬细胞会在清除后1-2周内重新填充小鼠 (van Rooijen et al., 1989)，因此只有4-5天的时间窗口可以在小鼠中检测外源性巨噬细胞。

因此，至关重要的是要规划实验，以便BMDM的体外分化在此窗口期内完成并准备好使用。

①吸出BMDMs的培养基，用10 mL PBS清洗细胞。加入5 mL Trypsin-EDTA（Cat#40127ES）并在 37℃下孵育5分钟以使细胞从培养板上解离。

注意：BMDMs通常在条件培养基中培养第7天即可使用。完全分化的BMDMs示例见图 1B。

②使用无菌细胞刮刀（Cat#84508ES）将细胞从培养板上刮下。

a. 将细胞转移到50 mL锥形管（Cat#83507ES）中。用5 mL PBS (pH 7.0)冲洗培养皿2-3次，并将冲洗液转移到含有收获细胞的离心管中。

b. 轻轻吹打细胞溶液几次以分散细胞团块。

③1400 rpm离心5分钟（25℃）沉淀细胞。用无菌PBS (pH 7.0)清洗细胞 2-3 次。

④用5 mL无菌PBS重悬细胞。用血细胞计数板计数细胞。

⑤1400 rpm离心5分钟（25℃）沉淀细胞。去除上清液，并将细胞重悬于无菌PBS中，浓度为107个细胞/mL。

⑥如上所述，使用异氟烷麻醉受体小鼠（巨噬细胞清除后的小鼠）。

⑦用1 mL注射器吸取0.2 mL细胞溶液。使用28号针头通过眼眶后静脉窦缓慢注射0.2 mL BMDM溶液。

注意：每只小鼠注射2 x 106个BMDMs。可以注射0.2 mL PBS作为对照。BMDM溶液也可以通过尾静脉注射。

⑧注射完成后，将小鼠放回笼中。

注意：需观察小鼠，确保其完全从麻醉中恢复后方可离开。

重建后的小鼠是研究外源性巨噬细胞的体内平台。BMDM注射36小时后，小鼠即可用于实验。在此方案中，我们使用LPS诱导的脓毒症模型来研究重建BMDMs的体内功能 (Du et al., 2020)。

①将LPS溶解在无菌 PBS (pH 7.0) 中，浓度为10 mg/mL。

②称量小鼠体重。根据体重，计算要注射给小鼠的LPS溶液体积，剂量为20 μg/kg（体重）。

注意：对于LPS模型，小鼠的理想体重应>18克。

③用1 mL注射器取适量的LPS溶液，并使用28号针头腹膜内注射小鼠。

注意：注射时，在小鼠腹部右下象限以30°-40°角插入针头。一旦针头穿过皮肤和腹膜衬里，角度应与胃平行以避免刺穿器官。PBS可用作注射对照。

④分析小鼠。

注意：LPS注射后几小时内，小鼠会出现体温过低，在此LPS剂量下，多达50%的C57BL/6小鼠可能在72小时内死亡。LPS注射会引起严重的全身炎症和多器官损伤。可以在不同时间点安乐死小鼠进行分析。

在本研究中，我们旨在评估SOCS1是否在YTHDF1下游发挥调节巨噬细胞激活的作用。为此，我们从野生型(WT)和YTHDF1(-/-)小鼠中衍生出BMDMs，然后分别用SOCS1-慢病毒或GFP (Ctrl)-慢病毒转导这些WT和YTHDF1(-/-) BMDMs。我们清除了WT小鼠的巨噬细胞，然后用SOCS1-或GFP (Ctrl)-转导的WT或YTHDF1(-/-) BMDMs重建这些小鼠。最后，我们将这些重建的小鼠置于LPS诱导的脓毒症模型中。如图4所示，与接受Ctrl-转导WT BMDMs的小鼠相比，接受 Ctrl-转导 YTHDF1(-/-) BMDMs 的小鼠在 LPS 攻击后死亡率要高得多（24 小时内 100% 死亡）（图 4A），这是预期的。接受 Ctrl-转导 YTHDF1(-/-) BMDMs 的小鼠产生的血清炎症细胞因子水平远高于接受 Ctrl-转导 WT BMDMs 的小鼠（图 4B），这也是预期的。这些观察结果表明慢病毒转导和清除/重建程序均成功（因为所有受体小鼠均为 WT 小鼠，如果程序不起作用，受体小鼠的表型应相同）。当接受 SOCS1-转导 YTHDF1(-/-) BMDMs 的小鼠接受 LPS 治疗时，高死亡率得到了预防（图 4A），并且血清炎症细胞因子水平降低到了 Ctrl 水平（图 4B）。这些数据表明，清除/重建程序确实是研究外源性巨噬细胞体内功能的绝佳系统。

 图 4. 过表达 SOCS1 可纠正小鼠 YTHDF1⁻/⁻巨噬细胞的过度炎症表型

(A) 经 LPS 刺激后，分别回输野生型（WT）或 YTHDF1⁻/⁻骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）（并转染 SOCS1 慢病毒或对照慢病毒）的巨噬细胞剔除小鼠的生存曲线；p < 0.0001（YTHDF1⁻/⁻ + 对照 + LPS 组与其余各组比较）。

(B) 经 LPS 刺激后，分别回输野生型（WT）或 YTHDF1⁻/⁻骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）（并转染 SOCS1 慢病毒或对照慢病毒）的巨噬细胞剔除小鼠的血清细胞因子浓度。*p < 0.05，**p < 0.01；*p < 0.001，****p < 0.0001，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。所有数据均以平均值 ± 标准差（mean ± SD）** 表示。