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在mRNA技术飞速发展的今天，一步法体外转录已从新兴技术逐步成熟，成为临床级mRNA生产领域的主流行业标准。它将复杂的转录、加帽过程整合在单管、单步反应中完成，大幅简化了mRNA合成流程，提升了工艺可控性。

  

与传统分步体外转录方法相比，一步法在产物质量均一性、翻译效率及工艺稳定性上展现出显著优势，更能满足临床转化与规模化生产的需求。对于追求精准实验数据、致力于推动mRNA技术从实验室走向临床的研究者而言，掌握一步法技术是提升研究效率、加快成果转化的重要支撑。本文将提供一套详尽、可重复的标准化实验流程，助您高效掌握这一核心技术。

 

加帽方法对应不同路线

 

实验核心原理

  

1.Cap1-GAG等帽子类似物作为转录起始底物，可被T7 RNA聚合酶识别并整合到mRNA 5' 端。

2. T7 RNA聚合酶不再以 GTP为第一个底物，而是直接以Cap1-GAG三核苷酸为起始单元，在转录启动时一步形成完整Cap1结构，无需后续酶促修饰。永利3044集团官网采用低dsRNA突变型T7 RNA聚合酶，dsRNA副产物相比野生型降低10倍以上，显著降低免疫原性。

3. 修饰核苷酸（可选）

体系兼容N1-Me-pUTP、pseudo-UTP等修饰核苷酸，进一步降低免疫原性、提升翻译效率。

 

实验流程

  

以下是基于永利3044集团官网T7 High Yield RNA Synthesis Kit for Co-transcription (low dsRNA)的标准化实验流程（以20 μL反应体系为例）。

  

1. DNA模板制备（模板设计时加预定长度poly A尾）

  

带有双链T7启动子的线性化质粒或 PCR扩增产物都可以作为T7 RNA polymerase体外转录模板,  模板可以用TE缓冲液或RNase-free H2O溶解。

  

A.质粒模板 

将目的DNA插入含有T7启动子的质粒载体中, 限制性内切酶处理,待完全线性化后进行纯化。以Bsp QI为例, 质粒线性化常用的反应体系:

  

组分	体积(uL)
质粒DNA	1ug
10xDigestion Buffer 3	5
BspQ1(10 U/L)	5
RNase-free H2O	Up to 50

  

50℃孵育1 h。

注:①环状质粒由于没有有效的终止, 会转录出不同长度的RNA产物, 为了得到特定长度的RNA, 质粒必须完全线性化。

②质粒线性化所选限制性内切酶需要在启动子区域右侧、插入DNA片段的下游,  且在插入 DNA片段中没有该限制性内切酶识别位点。选择的限制性内切酶要能形成有义链5' 端突出结构或者平末端。

③为了避免蛋白及盐离子等对体系的影响, 质粒线性化后建议纯化后再作为模板进行体外转录。

  

B . PCR产物模板

带 T7 启动子的PCR产物可以作为体外转录模板。首先将T7启动子序列加在有义链的上游引物的5' 端,  然后在高保真酶作用下扩增含T7启动子的DNA模板,  随后进行转录。PCR产物可以不经纯化直接作为模板, 但纯化后会得到更高的RNA产出。

  

注:① PCR产物作为模板, 必须电泳确认产物特异性及浓度, 建议20μL反应体系投入2-5μL PCR产物。

②为了得到更多高品质RNA,推荐PCR产物胶回收之后再作为模板进行体外转录。

③长转录本(>1000nt) , 建议使用质粒线性化模板进行转录。

  

2. 体外转录  (以20uL反应体系为例)

  

2.1试剂解冻

（1）室温解冻10XTranscription Buffer和4种NTP(ATP、CTP、GTP、 UTP),充分混匀后, 短暂离心;10XTranscription Buffer置于室温, NTP置于冰上备用。

（2）分别将T7 RNA Polymerase Inorganic  pyrophosphatase和Murine RNase Inhibitor混匀,短暂离心,置于冰上备用。

  

2 .2室温配制共转录加帽体系  

  

组分	体积（uL）	终浓度
RNase-free H2O	Up to 20	-
10x Transcription Buffer	2	1x
CTP/GTP/ ATP/UTP (100 mM each)	2 each	10 mM each
Cap Analog (100mM)	2	10 mM
模板DNA	1ug	-
Murine RNase Inhibitor (40 U/uL)	0.5
Pyrophosphatase,Inorganic (0.1 U/uL)	0.4
T7 RNA Polymerase (250 U/uL)	1-1.6

 

该共转录法反应体系: 永利3044集团官网可以提供货号Cat#16222ES和10634ES的商品化产品, 该产品包含一步法需要的所有物料。

注：

①反应体系在室温配置。防止温度低引起亚精胺沉淀高浓度DNA模板。

②短转录本(<100nt), 模板可使用2μg, 转录时间增至4-8个小时。

③为了提高RNA质量,  建议使用质粒线性化模板进行转录。

④使用试剂、容器等无 RNase污染。

⑤ 20μL转录体系可获得100-200μg RNA, 若想获得更多RNA, 可等比例放大反应体系, 不影响反应。

⑥ Cap1-GAG用于起始序列为5' AG3' 的共转录加帽,  请在质粒设计时充分考虑。

 

2.3 37℃孵育

将上述反应液混合均匀, 短暂离心, 置于37℃孵育2-3 h。

  

2.4 DNase I处理 

转录反应完成后, 每管加入1μL DNase I(RNase-free), 混匀后, 短暂离心, 置于37℃孵育15-30min以去除模板DNA。

  

3. RNA纯化

转录获得的RNA可以选用RNA cleaner磁珠进行纯化 (Cat#12602), 也可以采用氯化锂沉淀法或柱纯化等, 以去除蛋白、游离的核苷酸。纯化后的RNA经电泳检测后可进行下游实验或存储于-80℃。

  

4. RNA定量

 

A. 紫外吸收法

游离核苷酸会影响定量的准确性, 采用此方法前请先进行RNA纯化。然后通过测定产物的A260读数来确定RNA的产量。

B. 染料法

用 Ribo Green染料进行RNA定量, 游离核苷酸不会影响定量,可以对纯化或未纯化的反应产物中的RNA进行准确定量。