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对于刚踏入mRNA领域的研究者而言，最具挑战的往往不是理论，而是具体的实验操作。mRNA技术路线包括经典的体外转录+酶法加帽，以及共转录法加帽，本文整理了一套经过实战检验的体外转录+酶法加帽的保姆级实操指南，新手也能轻松制备出高质量的 mRNA，为后续的细胞转染、动物实验奠定坚实基础。

  

一、实验前准备工作

1. 环境与人员

物理隔离：设立专门的RNA操作区，与DNA操作区、细菌培养区严格分开。实验前，使用RNase清除剂彻底擦拭超净台、移液器、冰盒、离心机转头等所有接触到的表面。

个人防护：全程佩戴无粉乳胶手套，避免手套接触皮肤或其他可能带菌的表面。佩戴口罩。

2. 耗材与试剂

耗材去酶：实验过程中使用 RNase-free枪头和EP管。所有试剂均用RNase-free H2O配制。

  

二、技术路线

A. 体外转录+酶法加帽（本文详解该实验方案）1. DNA模板制备→2.体外转录→3.RNA纯化→4.RNA定量→5.RNA大小及质量检测→6.酶法加帽→7.RNA纯化、定量和质量检测→8.加帽率检测

B. 共转录法加帽（实验方案详见另一篇文章：一步法mRNA体外转录原理与实验流程详解）1. DNA模板制备→2.体外转录（共转录加帽）→3. RNA纯化→4.RNA定量→5.RNA大小及质量检测→6.加帽率检测

  

三、实验流程

  

以永利3044集团官网T7 High Yield RNA Synthesis Kit 为例，演示20 μL标准反应体系的操作流程。

  

1. DNA模板制备（模板设计时加预定长度poly A尾）

  

带有双链T7启动子的线性化质粒或 PCR扩增产物都可以作为T7 RNA polymerase体外转录模板,  模板可以用TE缓冲液或RNase-free H2O溶解。

  

A.质粒模板 将目的DNA插入含有T7启动子的质粒载体中, 限制性内切酶处理,待完全线性化后进行纯化。以Bsp QI为例, 质粒线性化常用的反应体系:

  

组分	体积
质粒DNA	1ug
10 x Digestion Buffer 3	5
BspQ1(10U/uL)	1
RNase-free H2O	Up to 50

   

50℃孵育1 h。

注:①环状质粒由于没有有效的终止, 会转录出不同长度的RNA产物, 为了得到特定长度的RNA, 质粒必须完全线性化。

②质粒线性化所选限制性内切酶需要在启动子区域右侧、插入DNA片段的下游, 且在插入DNA片段中没有该限制性内切酶识别位点。选择的限制性内切酶要能形成有义链5' 端突出结构或者平末端。

③为了避免蛋白及盐离子等对体系的影响, 质粒线性化后建议纯化后再作为模板进行体外转录。

  

B . PCR产物模板

  

带 T7 启动子的PCR产物可以作为体外转录模板。首先将T7启动子序列加在有义链的上游引物的5' 端,  然后在高保真酶作用下扩增含T7启动子的DNA模板, 随后进行转录。PCR产物可以不经纯化直接作为模板, 但纯化后会得到更高的RNA产出。

  

注:① PCR产物作为模板, 必须电泳确认产物特异性及浓度, 建议20μL反应体系投入2-5μL PCR产物。

②为了得到更多高品质RNA,推荐PCR产物胶回收之后再作为模板进行体外转录。

③长转录本(>1000nt) , 建议使用质粒线性化模板进行转录。

  

2. 体外转录  (以20μL反应体系为例)

  

2.1试剂解冻

（1）室温解冻10X Transcription Buffer和4种NTP(ATP、CTP、GTP、 UTP),充分混匀后, 短暂离心;10X Transcription Buffer置于室温, NTP置于冰上备用。

（2）分别将T7 RNA Polymerase Inorganic  pyrophosphatase和Murine RNase Inhibitor混匀,短暂离心,置于冰上备用。

  

2 .2室温配制转录体系

 

 

组分	体积（uL）	最终浓度
RNase-free H20	Up to 20	-
10xTranscription Buffer	2	1x
CTP/GTP/ATP/UTP（100 mM each）	2 each	10 mM each
模板DNA	1ug	-
Murine RNase Inhibitor（40U/uL）	0.5
Pyrophosphatase	0.4
T7 RNA Polymerase（250U/uL)	1-1.6

 

①反应体系在室温配置。防止温度低引起亚精胺沉淀高浓度DNA模板。

②短转录本 (<100nt), 模板可使用2μg, 转录时间增至4-8个小时。

③为了提高RNA质量, 建议使用质粒线性化模板进行转录。

④使用试剂、容器等无RNase污染。

⑤ 20μL转录体系可获得100-200ug RNA, 若想获得更多RNA,可等比例放大反应体系, 不影响反应。

  

2.3 37℃孵育

将上述反应液混合均匀, 短暂离心, 置于37℃孵育2-3 h。

  

2.4 DNase I处理 

转录反应完成后, 每管加入1μL DNase I（RNase-free）, 混匀后, 短暂离心, 置于37℃孵育15-30min以去除模板DNA。

  

3. RNA纯化

转录获得的RNA可以选用RNA Cleaner磁珠进行纯化(Cat#12602), 也可以采用氯化锂沉淀法或柱纯化等, 以去除蛋白、游离的核苷酸。纯化后的RNA经电泳检测后可进行下游实验或存储于-80℃。

  

4. RNA定量

A. 紫外吸收法

游离核苷酸会影响定量的准确性,采用此方法前请先进行RNA纯化。然后通过测定产物的A260读数来确定RNA的产量。

B. 染料法

用Ribo Green染料进行RNA定量, 游离核苷酸不会影响定量,可以对纯化或未纯化的反应产物中的RNA进行准确定量。