研究背景

胰腺癌是消化道常见恶性肿瘤之一，在肿瘤领域有“癌症之王”的称号。据柳叶刀杂志记载，胰腺癌确诊后的五年生存率约为10%，是预后最差的恶性肿瘤之一。胰腺癌临床症状隐匿且不典型，是诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤。因此适用于研究胰腺癌生理特性和治疗方案的类器官模型，作为一种疾病模型和再生医学，在胰腺领域至关重要，也被越来越多的科研工作者所关注并使用。

胰腺类器官的现状

目前, 类器官培养技术在很多器官(如胃、肠、肝、胆、脑等)中都取得了较好的进展。胰腺是人体内唯一的一个既是外分泌腺又是内分泌腺的特殊脏器。因此, 胰腺类器官技术的发展面临很大的挑战。

胰腺分为外分泌部和内分泌部两部分，外分泌腺由腺泡和腺管（导管）组成，内分泌腺由胰岛组成，外分泌腺是胰腺炎和胰腺导管腺癌（PDAC）的起源部位。我们对人类胰腺疾病（包括PDAC）的起源和进展的了解有限，因为虽然胰腺导管类器官和胰岛类器官技术日趋优化，但是体外培养中维持人腺泡和导管细胞存在挑战，如何构建复合型胰腺类器官仍是当前研究的难点。

胰腺类器官可以由健康的胰腺或胰腺肿瘤产生，并构成体外和体内模型之间的重要翻译桥梁。文章报道了人类多能干细胞对胰腺导管和腺泡类器官的诱导，这些类器官具有新生儿外分泌胰腺的特性。我们开发了一种可再生的导管和腺泡类器官来源，用于模拟外分泌发育和疾病，具体方案和操作如下：

培养方案

1.细胞准备

胰腺祖细胞由研究团队从Hues-8 细胞中提取，收集S1+4 d诱导阶段的PP2细胞团，并用TrypLE解离成单细胞。将消化的细胞以1500 rpm离心5分钟，然后用含有5%基质胶的分化培养基重悬，最终细胞密度为50000/mL。将细胞悬液接种在预涂有100%基质胶的培养板中，每四天更换一次培养基，并补充5%基质胶。

2. 胰腺导管诱导

对于导管细胞诱导，分化（碱性）培养基培养基中含有DMEM，1% Pen-Strep，1% B-27，10 ng/mL FGF-1，50 μg/mL抗坏血酸，1 μM A 83-01，10 ng/mL FGF-10，1 ng/mL EGF。

I 期（第0-4天）导管培养基含有碱性培养基，并添加10 μM Y-27632、50 nM SB939、3 μM IWP-2、25 nM IQ-1、50 nM iCRT14、15 ng FGF-10、10 ng/mL FGF-2、5 ng/mL EGF。

Ⅱ期（第4-8天）导管培养基含有碱性培养基，并添加3 μM IWP-2、25 nM IQ-1、50 nM iCRT14、5 μM Y-27632。

III期（第8-12天）导管培养基含有碱性培养基，并添加3 μM IWP-2、25 nM IQ-1、50 nM iCRT14，0.1 μM XAV-939。

IV期（第12天）导管培养基含有碱性培养基，并添加3 μM IWP-2、5 nM IQ-1、10 nM iCRT14。

图1.A. 导管样和腺泡样类器官诱导方案示意图 B. 16天培养期间类器官的相位对比图像(n = 3，独立培养)，比例尺，50毫米

图2.DUs和ac培养16天胰导管标志物SOX9 (A)、HNF1B (B)、CAII (C)、CFTR (D)的RNA表达。

图3.免疫荧光检测sox9 (E)和CAII(F)无机物的表达

3. 胰腺腺泡诱导

对于腺泡诱导，碱性培养基含有DMEM，1% Pen-Strep，1% B-27，10 ng/mL FGF-1，50 μg/mL抗坏血酸，1 μM A 83-01，10 ng/mL WNT1。

I 期腺泡（第 0-4 天）培养基含有碱性培养基，并添加10 μM Y-27632、3 μM SKL 2001、50 nM 地塞米松、0.3 μM CHIR-99021、50 nM XMU-MP-1、15 ng/mL WNT1、5 ng/mL FGF-2、1 ng/mL EGF、5 ng/mL FGF-10。

Ⅱ期（第4-8天）腺泡培养基含有碱性培养基，并添加3 μM SKL 2001、200 nM地塞米松、0.1μM LDN193189、50 nM XMU-MP-1。

III期（第8-12天）腺泡培养基含有碱性培养基，并添加3 μM SKL 2001、200 nM地塞米松、0.1 μM LDN193189、1 μM DBZ。

IV期（第12天）腺泡培养基含有碱性培养基，并添加0 .3 μM SKL 2001、25 nM地塞米松、0.1 μM DBZ。

对于TGF-β处理的实验，从第83天开始从培养基中去除A 83-01。

图4.DUs和ac培养16天胰腺腺泡标记物PTF1A (G)、RBPJL (H)和CPA1 (I)的RNA表达

图5.免疫荧光检测类器官中PTF1A (J)和CPA1 (K)的表达

化合物信息汇总如下表所示：

化合物名称	货号	规格
Penicillin-Streptomycin(100×)	60162ES	100 mL
B-27 supplement without Vitamin A,serum free,50X	60704ES	10 mL
L-抗坏血酸	53614ES	1 g/5 g
Forskolin	51001ES	10/50/100 mg
Retinoic acid(维甲酸,维A酸)	53001ES	100/500 mg/1 g
A 83-01	53002ES	1/5/10 mg
Y-27632	53006ES	1/5/10 mg
CHIR-99021	53003ES	2/5/10 mg
Doxycycline (powder)	60204ES	1/5/25 g
Dexamethasone地塞米松	53269ES	250/500 mg/1 g
LDN193189	53012ES	5/10 mg
IWP-2	53013ES	5/10/50 mg
SKL 2001	53542ES	10/50 mg
XAV-939	52904ES	10/25 mg
DBZ	52984ES	2/5/10/25 mg
XMU-MP-1	53544ES	2/5 mg
IQ-1	53541ES	10/25 mg
iCRT14	53552ES	5/25 mg
SB939 (Pracinostat)	53840ES	2/5 mg
FGF-1	91301ES	10/100/500 μg
FGF-10	91306ES	5/100/500 μg
FGF-2	91330ES	10/100/500 μg
EGF	92708ES	100/500 μg
Ceturegel^® Matrix for Organoid culture，Phenol Red-Free，LDEV-Free 基质胶	40191ES08/10	5mL/10mL

参考文献

[1] Huang L, et al. Commitment and oncogene-induced plasticity of human stem cell-derived pancreatic acinar and ductal organoids. Cell Stem Cell. 2021 Jun 3;28(6):1090-1104.e6. doi: 10.1016/j.stem.2021.03.022. Epub 2021 Apr 28. PMID: 33915081; PMCID: PMC8202734.

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