• 样本裂解：将植物叶片在液氮中研磨成粉末，转移至离心管。加入裂解液和RNase A，涡旋混匀。

• 杂质去除：加入絮凝剂，冰浴离心，去除沉淀（含多糖多酚）。

• 结合与纯化：转移上清，加入异丙醇和磁珠。混匀后置于磁力架上吸附，弃去废液。加入洗涤液A和B各两次，洗涤杂质。

• 洗脱：空气干燥磁珠，加入洗脱液，65℃震荡孵育洗脱DNA。

• 保存： -20℃短期保存或-80℃长期保存。

Post-BS法先进行亚硫酸氢盐转化，再以单链DNA为模板进行建库，适用于微量样本（10 pg-250 ng）。

2.A.1 试剂准备

• 超快速DNA亚硫酸氢盐转化试剂盒（磁珠法），Cat#12229ES

• 单链DNA甲基化建库试剂盒，Cat#12221

• PCR Index引物，Cat#12414ES-12415ES

• DNA Selection Beads磁珠，Cat#12601ES

• 无水乙醇（新鲜配制80%乙醇）

• ssDNA Assay Kit for Qubit，Cat#12645ES

2.A.2 仪器设备

• PCR仪（带热盖）

• 磁力架（适用于1.5 mL离心管和PCR管）

• 金属浴（55℃）

• 涡旋振荡器

• 离心机

• Agilent 2100 Bioanalyzer（或等效设备）

• Qubit荧光计

• DNA片段化：将提取的DNA通过超声或酶切打断至200-500bp

• 试剂准备：洗涤液按规格加入无水乙醇，颠倒混匀备用；转化液有结晶可 50℃加热溶解，磁珠使用前充分振荡。

• 亚硫酸氢盐转化：在无核酸酶 PCR 管中混合 DNA 与转化液，混匀离心后，PCR 仪 95℃反应 10 分钟，4℃保温。

• 产物结合：将转化液转入离心管，加结合液和磁珠混匀，室温孵育 5-10 分钟。

• 磁珠分离与洗涤：磁力架分离弃上清，加洗涤液混匀后再次磁力分离弃上清。

• 脱硫处理：加脱硫液混匀，室温孵育 15 分钟，磁力分离弃上清。

• 二次洗涤：用洗涤液重复洗涤两次，磁力分离后尽量弃尽残留液体。

• 磁珠干燥：55℃金属浴孵育 5-10 分钟或室温干燥 20-30 分钟，确保磁珠完全干透。

• DNA 洗脱：加洗脱液混匀，55℃孵育 5 分钟，磁力分离后取上清，即得转化后 DNA，可直接下游实验或低温保存

• DNA 预处理：将片段化 DNA 补水至 30μL，95℃变性 3min 后立即冰浴 2min，保持单链状态。

• 3’接头连接：冰上配制连接预混液，加入变性 DNA 后，37℃反应 15min、95℃失活 2min，完成 3’端接头连接。

• 互补链延伸：向连接产物加入延伸试剂，按程序完成互补链合成，得到双链 DNA。

• 第一次纯化：用 1.2× 磁珠纯化延伸产物，乙醇漂洗、干燥后用水洗脱，取上清备用。

• 5’接头连接：向纯化产物加连接缓冲液、5’接头与连接酶，20℃反应 15min，完成 5’端接头连接。

• 第二次纯化：用 0.6× 磁珠纯化 5’连接产物，洗脱后取上清用于扩增。

• 文库扩增：加入扩增 Mix 与 Index 引物，按起始量选择循环数进行 PCR，获得足量文库。

• 终纯化：用 0.85× 磁珠纯化扩增产物，干燥洗脱，得到可测序的最终甲基化文库。

• 文库质控：用 qPCR 定量、Bioanalyzer 检测片段分布，评估文库质量。