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在分子生物学实验中，有一句经典名言："RNA质量决定实验结果的上限"。高质量的RNA是RT-qPCR、RNA-seq等下游应用成功的前提。然而，在RNA提取过程中，有一个"隐形敌人"常常悄然而至，污染我们的样本，干扰定量结果，甚至导致实验完全失败——它就是基因组DNA（gDNA）残留。

如何有效清除gDNA而不损伤珍贵的RNA？DNase I，正是这把"剔除污染"的利器。

一、背景：RNA提取的核心挑战

1.1 RNA提取的四大基本步骤

成功分离完整的RNA需要四个基本步骤：有效裂解细胞或组织、核蛋白复合物变性、内源性核糖核酸酶（RNase）失活以及去除污染的DNA和蛋白。其中最重要的步骤是在细胞破裂后快速灭活内源性核糖核酸酶。总RNA纯化试剂盒通常含有硫氰酸胍（GTC），它既能破坏细胞结构使RNA释放，又能使核糖核酸酶失活。GTC破坏核蛋白复合物，使RNA释放到溶液中并分离出不含蛋白质的复合物。然而，在这个过程中，基因组DNA也会同时被释放，如果不去除，这些DNA将在下游应用中产生严重的干扰。

1.2 gDNA污染的危害

在RT-qPCR中，如果引物无法区分cDNA和gDNA（如引物设计不跨外显子-外显子边界），gDNA将作为模板被扩增，产生虚假的阳性信号。gDNA的存在会导致RNA定量不准，A260读数偏高，使得实际用于下游反应的RNA量低于预期。在RNA-seq中，gDNA reads会占用测序数据量，降低有效数据的比例。

有研究显示，即使微量的gDNA污染，也可能导致基因表达定量结果产生数倍的偏差。因此，去除gDNA是RNA提取中不可或缺的关键步骤。

二、实验原理：DNase I的作用机制

2.1 DNase I是什么？

脱氧核糖核酸酶I（Deoxyribonuclease I, DNase I）是一种从牛胰腺中分离纯化的核酸内切酶，经过特殊处理将其RNase活性降低至检测不到的水平。这意味着它能够特异性地切割DNA，而不会损伤RNA。

2.2 DNase I的作用机制

DNase I是一种可以消化单链或双链DNA的非特异性核酸内切酶，水解单链或双链DNA后的产物5'端为磷酸基团，3'端为羟基。DNase I 活性依赖于钙离子（Ca²⁺），并能被镁离子（Mg²⁺）或二价锰离子（Mn²⁺）激活。当Mg²⁺存在时，酶在双链上随机切断，产生长短不一的缺口；若换成Mn²⁺，则于同一位置同时切断两链，得到平末端或带1–2 nt突出的粘末端。

在RNA提取的标准流程中，通常在含Mg²⁺的缓冲体系中进行消化，使DNase I发挥最佳活性。

图1：DNase I在Mg2+以及Mn2+存在下可切割dsDNA原理图（图片来源：网，侵删）

2.3 DNase I的来源

主流来源包括动物来源（牛胰腺提取）、大肠杆菌重组表达、毕赤酵母分泌表达三种技术路线。

表1 DNase I的来源

维度	动物来源 （牛胰腺提取）	大肠杆菌重组表达	毕赤酵母分泌表达
来源	从牛胰腺组织中直接提取、纯化天然酶。	将DNase I基因转入大肠杆菌，在胞内表达后破碎菌体提取。	将DNase I基因转入毕赤酵母，诱导分泌表达。
核心优势	生产成本低、生产工艺成熟、酶天然构象完整，酶活高	生产周期短、易于大规模生产、无RNase污染、无动物源风险	纯度高、无内毒素、无RNase污染、真核表达系统可进行适当的翻译后修饰，酶构象更接近天然状态
核心劣势	纯度较低、有RNase污染风险，动物源风险	有内毒素风险、重组蛋白可能折叠不完全，影响酶活性或稳定性	生产成本高

三、技术应用：DNase I在不同场景中的使用

DNase I的应用范围极其广泛，几乎涵盖了所有涉及RNA操作的领域。下面列举几个比较常见的例子：

高灵敏度qRT-PCR：这是DNase I应用最广泛的场景。特别是在检测低丰度基因或进行绝对定量时，必须确保模板中无gDNA，否则Ct值将严重失真。

二代测序（NGS）：在构建RNA-Seq文库时，去除生物体中大量的rRNA，能够提高有效数据量，节省测序成本，也为后续的生信分析减低了难度。目前，rRNA的去除方式以RNA酶消法为主，主要操作步骤为先提取Total RNA；而后单链DNA探针和rRNA分子杂交结合（注：需要设计与合成rRNA 特异性单链 DNA 探针）；RNase H降解杂交的rRNA；DNase I降解DNA 探针；最后rRNA被成功去除，剩下非rRNA的RNA模板。

图2：基于酶法的rRNA去除原理示意图（图片来源：网，侵删）

体外转录：在体外转录实验中，常用T7、T3、SP6等RNA聚合酶进行RNA合成。然而，合成后的RNA可能会有DNA残留，若用于mRNA疫苗生产制作，则必须用DNase I去除模板DNA残留，且不能引入会引起免疫反应的杂质。例如，在制备mRNA疫苗时，需要确保RNA样品中不含有任何DNA污染，否则可能会影响疫苗的安全性和有效性。DNase I能够高效地去除模板DNA，保证RNA疫苗的质量。

四、总结

在RNA提取中，DNase I是一把不可或缺的利器，它精准地切割基因组DNA，却不损伤珍贵的RNA，为下游的RT-qPCR、RNA-seq等高灵敏度应用扫清了障碍。从离心柱法的柱上消化，到磁珠法自动化流程的整合，再到液相RNA的单独处理，DNase I以其灵活性和高效性，适应着不同实验室、不同样本类型、不同通量的需求。

选择高质量的DNase I，关键在于确保其无RNase活性。永利3044集团官网提供的RNase-free DNase I，经过严格质检，确保在高效去除gDNA的同时，完整保留您的RNA样本，让您的实验数据更加真实可靠。

永利3044集团官网DNase I选择指南

产品特点	产品货号	规格	应用方向
脱氧核糖核酸酶I(DNase I)，来源于牛胰腺;经色谱工艺制备，核糖核酸酶A（RNase A）活性含量极低。为冻干粉剂。贮存温度-25℃~-15℃。	10607ES	10607ES15:15 KU 10607ES81:10×15KU	1、从样本中提取RNA时去除gDNA。（如果是微量样本，需要用重组来源的DNase I） 2、蛋白质研究: 从蛋白制备物中去除 DNA。
脱氧核糖核酸酶I(DNase I)，来源于牛胰腺;经色谱工艺制备，核糖核酸酶A（RNase A）活性含量极低（≤0.0005%）。为冻干粉剂。贮存温度-25℃~-15℃	10608ES	10608ES25:25mg 10608ES60:100mg 10608ES80:1g
重组来源DNase I (RNase-free)，大肠杆菌重组表达，不含RNase，液体形式，贮存温度-25℃~-15℃。	10325ES	10325ES80：1000 U 10325ES90:5×1000 U 10325ES91:5000 U	适用于各种应用：RNA提取过程中的基因组DNA去除、反转录前的基因组DNA清除、体外转录后模板DNA的消化、RNA建库过程中rRNA去除、缺口平移法进行DNA标记、DNase I足迹法分析实验、从蛋白制备物中去除DNA等。
重组来源DNase I (RNase-free)，毕赤酵母重组表达，不含RNase，液体形式，贮存温度-25℃~-15℃	14549ES	1000 U 5000 U
	14550ES	50 T 200 T
重组来源DNase I (RNase-free)，大肠杆菌重组表达，GMP-grade，液体形式，贮存温度-25℃~-15℃。	10611ES	10611ES76:500U 10611ES84:2000U 10611ES92:10000U 10611ES98:100KU	GMP药用级别。用于采用药用规格原辅料生产，符合GMP规范的产品生产与质量管理规程保障生产过程及所有原辅料可追溯。