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基因突变的检测在急性髓系白血病（AML）伴重现性遗传学异常、遗传易感性髓系肿瘤、骨髓增殖性肿瘤（MPN）、骨髓增生异常综合征伴环形铁粒幼红细胞（MDS-RS）、毛细胞白血病（HCL）和淋巴浆细胞淋巴瘤/华氏巨球蛋白血症（LPL/WM）的诊断中具有关键性的作用，对于其他血液肿瘤则起到辅助诊断的作用。

基因突变是各类血液肿瘤预后判断的重要依据，目前NCCN指南已提出了基于基因突变的AML预后分层体系。此外，MDS、MPN、MDS/MPN、急性淋巴细胞白血病（ALL）、慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤（CLL/SLL）、LPL/WM、大颗粒淋巴细胞白血病（LGLL）中，已经证实了一些具有明确预后意义的突变基因。其他血液肿瘤中突变基因的预后意义尚有待于进一步研究。

一方面，基因突变检测可提供分子治疗靶点，对应靶向药物进行治疗，目前已有基于突变基因的靶向药物应用于临床或处于临床试验阶段，其中FLT3、IDH1/2、BRAF及JAK-STAT信号通路相关的突变基因已有靶向药物上市；

另一方面，基因突变可以导致对某些药物的敏感或者耐受，及时检测有助于治疗方案的调整。例如，TP53突变的CLL/SLL患者对常规化疗反应差，MYD88和CXCR4基因突变可影响伊布替尼在LPL/WM中的治疗效果，ABL1激酶区突变是慢性髓性白血病（CML）和Ph+ ALL酪氨酸激酶抑制剂（TKI）耐受的主要机制之一。

基因突变是MRD监测的分子标志物之一。虽然实时定量PCR方法和流式细胞学是目前主流的MRD监测方法，但是由于NGS灵敏度随测序深度加深可进一步提高，在MRD监测方面具有更大的优势。

血液肿瘤在发展过程中会伴随动态的克隆演变，或是基因突变负荷的改变，或是新的突变基因的出现，及时监测基因改变，有助于了解疾病进展并调整治疗方案。

骨髓采集量以1~3 ml为宜，外周血采集量3~5 ml为宜，若白细胞计数偏高或偏低，应适当调整采集量，使单个核细胞总数达到1×107以上。抗凝剂首选EDTA抗凝剂或枸橼酸钠抗凝剂，禁止使用肝素抗凝，推荐24 h内4 ℃冷藏运送。福尔马林固定后的组织标本需选择肿瘤成分，切片厚度8~10 µm，5~8片为宜，常温运输。已染色标本不推荐进行NGS检测。条件允许的病例，可从同一患者采取正常组织作为胚系突变对照。

DNA质量是NGS检测成功的关键因素，同一患者的不同病灶组织、不同组织切片应分别单独进行DNA提取，并对DNA质量进行评估，包括浓度、纯度和完整性分析。

文库制备用于目标区域的富集，主要有杂交捕获法和扩增子建库法。文库浓度过高会导致多克隆数据的产生，降低有效测序数据量；过低会导致整体测序数据的减少，因此在测序之前推荐使用实时定量PCR或其他方法对文库进行定量，将文库浓度调整至合适的水平。每个检测项目应设定其文库质量的要求，并设立明确的合格文库标准。

可以根据实际应用选择Illumina 平台或者MGI平台测序。

在对测序结果进行具体的生物信息学分析之前，要先对下机数据进行质量评估，制定有效的质量控制标准，包括碱基的质量Q20、目标区域平均测序深度、均一性等评价参数。血液肿瘤的基因突变检测，测序深度应≥500×，平均测序覆盖度、均一性以及在靶率均≥90%。

数据过滤所针对的读段主要有四种：测序质量低的读段（low quality reads），重复读段（duplicate reads），含有核苷酸的插入、删除和替换等错误的读段（insertion/deletion/mismatch）和带有人工污染的读段（adaptor等）。常用的数据过滤软件有Trimmomatic、Fastx_toolkit、NGS QC Toolkit等。

当读段经过质控与过滤等步骤达到一定的质量标准之后，需要将其比对到参考基因组上。目前普遍参考的人类基因组参考序列为Human hg19。不同的比对方法根据不同的比对策略设计了不同的算法，常用的比对程序软件有MAQ、BWA、Bowtie/Bowtie2、SOAP/SOAP2、mrFAST和Stampy等。

突变位点识别常借助于Samtools、GATK等识别工具。对突变位点的注释内容包括功能信息、频率信息、软件预测结果信息以及疾病数据库信息，常用的包括Ensembl、RefSeq、GENCODE、dbSNP、1000genomes、ESP、ExAC、COSMIC、HGMD、Clinvar、polyphen和SIFT等。

筛选与鉴别疾病相关突变位点需要经过严格的筛选流程，至少需要排除低质量变异、未有明确意义的非编码区变异、同义单核苷酸变异（SNV）及已知健康人群中的基因多态性位点。