肾脏类器官培养案例 | 人肾脏类器官培养手册
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2023-03-23
肾脏是人体中重要器官之一，具有清除代谢废物，维持电解质平衡等生理功能，保证机体内环境的稳定。肾脏类器官(kidney organoid)是肾脏功能的3D模型，有利于人类肾脏疾病的建模，大多由多能人类干细胞(PSC)在体外经诱导生成，能够表达出和人肾单位相似的各类结构，如肾小球足细胞、近端小管、远端小管、集合管等。
我们根据Nat Protoc.[1]发表的文章，整理了人类多能干细胞生成肾脏类器官的培养方案。
图1.hPSC分化为肾脏类器官的过程(PMID: 28005067)[1]
hPSC接种到包被了无LDEV低生长因子基底膜基质的6孔板上，用ReproFF2培养基（含有10 ng/mL FGF2）培养。健康的未分化hPSC显示出边界清晰的圆形集落形态，使用iPS细胞的解离溶液分离健康的未分化hPSC，每七天传代。
当细胞密度达到80%时，使用Accutase消化细胞，用ReproFF2培养基(含10 μM Y-27632（Cat# 53006ES）或Y-27632 dihydrochloride（Cat# 52604ES）)重悬，接种到包被了无LDEV低生长因子基底膜基质的24孔板上，培养3天，更换为Advanced RPMI 1640培养基（含有1× L-GlutaMAX，3~10 μM CHIR-99021，5-25 ng/mL Noggin，100-500 nM Dorsomorphin）继续培养，每两天换液，直至细胞形态为松散形成的密集细胞团（一般需要96 h）。然后更换为Advanced RPMI 1640培养基（含有1× L-GlutaMAX，10 ng/mL activin A）继续培养2-3天。
更换为Advanced RPMI 1640培养基（含有1× L-GlutaMAX，10 ng/mL FGF9）继续培养2天。
图2.hPSC分化过程中的形态变化(PMID: 28005067)[1]
Day 0，分化开始时未分化的hPSC (H9)；Day 4，晚期原始条纹阶段；Day 9，肾单位祖细胞期. Day 14，肾囊泡期；Day 21，肾单位期；在第4天进行激活素A处理的细胞的最佳形态是可见松散密集的簇。
4.1 NPC向肾脏类器官的分化(2D)
步骤3后更换为Advanced RPMI 1640培养基（含有1× L-GlutaMAX，10 ng/mL FGF9，3 μM CHIR-99021）继续培养2天；然后更换为Advanced RPMI 1640培养基（含有1× L-GlutaMAX，10 ng/mL FGF9）培养2-3天，如果观察到类似肾小泡的带有管腔的圆极化结构，则继续下一步。如果在3天内未观察到肾泡结构，则通过免疫染色确认LHX1是否表达；然后更换为Advanced RPMI 1640培养基（含有1× L-GlutaMAX）培养，每2-3天换液，肾脏类器官在至少长达3个月的分化中是稳定的，肾单位结构可以用显微镜识别。
4.2 hPSC向肾脏类器官的分化(3D)
步骤2后使用Accutase消化细胞，用Advanced RPMI 1640培养基（含有1× L-GlutaMAX，10 ng/mL FGF9，3 μM CHIR-99021）重悬后接种于超低吸附的圆底96孔板中，培养2天，然后更换为Advanced RPMI 1640培养基（含有1× L-GlutaMAX，10 ng/mL FGF9）继续培养2-3天，直到显微镜观察到肾泡状圆形结构。
图3.NPC和肾单位的免疫染色(PMID: 28005067)[1]
(a)分化第9天SIX2的免疫荧光显示NPC。比例尺：50 μm；(b)免疫荧光染色鉴别分化2D培养中第21天的肾单位结构。比例尺：50 μm；(c) 在3D培养中分化的第21天用冷冻切片识别肾单位结构，比例尺：50 μm；(d) 3D培养中第28天（左，比例尺：50 μm）和第21天（右，比例尺100 μm）肾单位的免疫染色，PODXL：一种足细胞标记物，LTL：一种近端小管标记物，CDH1：Henle环和远端小管标记物；(e)3D培养中第21天类器官的明场图像，箭头表示肾小球结构。
Melissa H. Little团队于Nature Protocols发表研究，提出一种优化方案：通过延长分化周期并使用CDBLY2培养基，增强后肾祖细胞定向分化及肾单位祖细胞自我更新能力，从而从人多能干细胞高效构建近端肾小管功能强化的肾类器官[3]。
1. 细胞铺板与初始诱导（第0-5天）
将人多能干细胞（hPSCs）以每孔25,000个的密度接种于Laminin-521包被的培养板。第0天，在确认细胞状态良好、未出现自发分化且密度合适后，移除E8培养基，加入含6 µM CHIR-99021的E6培养基（1 mL/孔）。将细胞置于CO₂培养箱中培养，每48小时更换新鲜E6/CHIR培养基，持续至第5天。
2. FGF9诱导期（第5-8天）
第5天起，将培养基更换为添加200 ng/mL FGF9和1 µg/mL肝素的E6培养基，每2-3天换液。此阶段旨在促进后肾谱系定向分化。
3. CDBLY2扩增期（第8-13天）
从第8天开始，改用CDBLY2培养基进行每日换液，直至第13天。期间需持续镜检监测，确保细胞未发生上皮化，以保证后续三维培养的成功率。
4. 3D成熟类器官培养期（第13-27天）
吸除CDBLY2培养基，先用1 mL TrypLE Select清洗细胞，再加入新鲜TrypLE Select孵育3分钟。收集细胞后离心，将细胞微团（每孔3个）转移至Transwell膜表面。向Transwell下室加入含5 µM CHIR-99021的E6培养基，37°C孵育1小时完成CHIR脉冲处理。随后更换为含200 ng/mL FGF9和1 µg/mL肝素的E6培养基，继续培养至第18天。第18天后，改用不含FGF9和肝素的E6培养基，隔天换液，直至第27天获得成熟肾类器官。
图4 近端肾小管增强肾类器官构建流程
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产品名称 |
产品编号 |
规格 |
简介 |
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53006ES |
1 mg/5 mg/10 mg |
ROCK抑制剂 |
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53003ES |
2 mg/5 mg/10 mg |
GSK-3α/β抑制剂 |
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53593ES |
5 mg/25 mg |
AMPK选择性抑制剂 |
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92528ES |
5 μg/100 μg/500 μg |
重组蛋白 |
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91702ES |
10 μg/100 μg/500 μg |
重组蛋白 |
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91305ES |
5 μg/100 μg/500 μg |
重组蛋白 |
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91306ES |
5 μg/100 μg/500 μg |
重组蛋白 |
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91330ES |
10 μg/100 μg/500 μg |
重组蛋白 |
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40506ES |
100 mL |
细胞消化液 |
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738416ES |
100 mg |
细胞培养添加剂 |
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60701ES |
100 mL |
细胞培养添加剂 |
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[1] Morizane R, et al. Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 2017 Jan;12(1):195-207.
[2] Little MH, et al. Generating Kidney from Stem Cells. Annu Rev Physiol. 2019 Feb 10;81:335-357.
（本文中的实验方案基于已发表文献优化整理，内容仅供参考，实际实验条件可能因细胞系差异、实验室环境等因素需调整，建议用户在正式实验前进行预实验优化。）
