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肝脏类器官培养案例 | 人肝脏类器官培养手册

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2023-03-23

背景介绍

肝脏是人体中最大的器官之一，来源于内胚层中前肠上皮细胞发育而来的肝芽结构，以代谢功能为主，发挥“解毒”作用。肝功能失衡会导致称为肝衰竭的病理状况，并导致肝炎、纤维化、肝硬化、癌症、代谢或自身免疫性疾病。因此，为充分了解每种肝病的表型和损伤器官的机制，我们需要体外个性化肝模型系统进行疾病建模、药物发现和药物毒性学习。

肝脏类器官(hepatic organoids, HLO, HO)是肝脏功能的3D模型，保留了肝细胞的主要生理特征。在存在或不存在基质的情况下，可以从iPSC、ESC或特定的成体细胞（例如上皮细胞或上皮细胞和间充质细胞）生成类器官。

肝脏类器官的培养方案

我们根据JCI Insight^[¹^]、Cell Metab^[²^]和J Hepatol^[³^]发表的三篇文章，整理了由人类诱导多能干细胞(human iPSCs)生成肝脏类器官的培养方案。

图1.iPSC分化为肝类器官的过程(PMID: 28878125)^[¹^]

A：iPSC分化为肝类器官的示意图；

B-C：在第0天(iPSCs)、第3天（定形内胚层，EN）、第6天（前肠，FG）、第9天（成肝细胞，HB)、第20天(HO1)和第62天(HO2)在HO发育过程中发生的形态学和细胞标记变化。

诱导定型内胚层

iPSC在含有5 mM EDTA和10 mM Y-27632（Cat# 53006ES）或Y-27632 dihydrochloride（Cat# 52604ES）的缓冲液解离为单个细胞，接种到低吸附的6孔板上，然后用含有激活素A (100 ng/mL)和BMP4 (10 ng/mL)的RPMI-1640培养基培养3天；

诱导前肠球体

第3 -6天，更换为含有1-2% Matrigel和B27的RPMI培养基，培养基中加入50 ng/mL FGF10；第6-9天，更换培养基，RPMI 中加入B27，FGF10 (10 ng/mL) ， BMP4 (10 ng/mL)，基质胶浓度维持为1-2%；

诱导类器官

第9天后，收集前肠样结构，更换为含有1% Matrigel、50 ng/mL HGF、50 ng/mL Oncostatin M和10 μM Dexamethasone的类器官生长和分化培养基(HCM)中。

图2.iPSC分化为肝类器官的过程(PMID: 31155493)^[²^]

A：iPSC分化为肝类器官的示意图；B：在第0天(iPSCs)和第20天(HLO)明场图像。

类器官扩增

解离HO1：在第20天收集培养物，1 mg/mL胶原酶，孵育37°C，30 min，再0.25% Trypsin-EDTA，10 min，200 g离心3 min收集细胞。

重编程为HO2：重悬于50 μL Matrigel中，接种到24孔板中。Matrigel凝固后，加入1 mL生长培养基(RPMI-1640, B27, 250 nM LDN-193189, 3 μM CHIR-99021, 10 μM A 83-01, 100 ng/mL EGF, 10 ng/mL FGF10和20 ng/mL HGF)，培养细胞6天，更换为分化培养基(HCM medium, 10 μM DAPT, 10 ng/mL Oncostatin M, 20 ng/mL HGF, 10 μM Dexamethasone, 10 ng/mL BMP4)再培养6天。

相关产品

产品名称	产品编号	规格	简介
Y-27632	53006ES	1 mg/5 mg/10 mg	ROCK抑制剂
RPMI1640培养基	41402ES	500 mL	培养基
EDTA	60126ES	500 g	防止细胞毒性
CHIR99021	53003ES	2 mg/5 mg/10 mg	GSK-3α/β抑制剂
Dexamethasone 地塞米松	53269ES	250 mg/500 mg/1 g	糖皮质激素受体激动剂
LDN193189	53012ES	5 mg/10 mg	BMP信号通路抑制剂
Forskolin毛喉素	51001ES	10 mg/50 mg/100 mg	升高cAMP，增强Wnt信号，促进肝祖细胞增殖
A 83-01	53002ES	1 mg/5 mg/10 mg	TGF-β信号抑制剂
DAPT	52104ES	10 mg/50 mg	Notch通路抑制剂
human BMP4	92053ES	10 μg/100 μg/500 μg	重组蛋白
human EGF	92708ES	100 μg/500 μg	重组蛋白
human Activin A	91702ES	10 μg/100 μg/500 μg	重组蛋白
human FGF4	91303ES	5 μg/100 μg/500 μg	重组蛋白
human FGF10	91306ES	5 μg/100 μg/500 μg	重组蛋白
human HGF	92055ES	10 μg/50 μg/1 mg	重组蛋白
human oncostatin M	92254ES	10 μg/100 μg/500 μg	重组蛋白
N-2 supplement,serum free,100X	60706ES	5 mL	用于细胞和组织体外培养
HEPES溶液(1 M)，细胞培养级	60117ES	100 mL	化学缓冲剂
Sodium Pyruvate丙酮酸钠	60370ES	10 g/100 g	抗氧化
BSA牛血清白蛋白,诊断级别	36102ES	25 g/100 g/500 g/1 kg	用于细胞培养
Human Fibronectin Protein	92619ES	1 mg/5 mg/10 mg/100 mg/1 g	重组蛋白
Dexamethasone 地塞米松	40323ES	1 mL/25 mg/100 mg	糖皮质激素受体
50× B-27无血清添加剂，去除维生素A	60704ES	10 mL	无血清添加剂
Ceturegel® Matrix for Organoid culture，Phenol Red-Free，LDEV-Free Plus 基质胶	40192ES	1.5mL/5mL/10mL	类器官专用培养基