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在生物制药领域，提到重组蛋白表达和质粒DNA扩增，大肠杆菌（E.coli）无疑是应用最广泛的宿主系统。遗传背景清晰、培养周期短、生产成本低，使其成为胰岛素、干扰素、白介素等重组蛋白药物，以及DNA疫苗、基因治疗用质粒DNA的“主力生产车间”。

在质粒纯化过程中，碱裂解是释放目的质粒DNA的关键步骤，但这一过程会导致宿主菌大量RNA被释放，并在碱性条件下随机断裂形成大小不一的RNA碎片。宿主细胞RNA（HCR）作为工艺相关杂质，其理化性质与质粒DNA相近，难以在后续层析步骤中完全分离，成为贯穿生物制品全流程的潜在风险来源。

1、干扰产品效力，降低治疗获益

残留的RNA碎片会干扰质粒的转染效率，进而影响目的基因在靶细胞中的表达水平，直接降低产品的生物学活性和治疗效益。对于依赖质粒转染的细胞治疗和基因治疗产品而言，这一影响尤为显著。

2、激活免疫通路，引发安全风险

外源性RNA是人体先天免疫系统的强效激活剂。残留的E. coli RNA可被细胞内的模式识别受体（如TLR3、TLR7、TLR8等）识别，激活干扰素信号通路，诱发非预期的炎症反应和免疫应答，给临床用药带来不可预估的安全隐患。

3、合规压力升级，检测标准日趋严格

全球主要监管机构已将宿主细胞RNA残留列为生物制品的关键质量属性（CQA）。无论是FDA、EMA还是国家药品监督管理局CDE，均在相关指导原则中明确要求对宿主细胞RNA残留进行检测和控制，且控制要求日益严格。未能建立完善的RNA残留检测方法，已成为企业申报和上市放行的重要障碍。

(1)符合法规：按照Chp、USP、ICHQ2（R2）等要求进行全面验证，性能符合中外法规标准；

(2)保障品质：试剂盒原材料全自主研发，qPCR Mix等酶产品在超洁净酶工厂生产；

(3)配合审计：保障试剂盒生产工艺稳定，批间差可控，有完善的审计文件；

(4)灵敏度高：定量下限(LLOQ)可达1fg/μL水平；

(5)专属性强：特异性检测E.coli细胞残留RNA，不受其他外源基因组DNA和RNA干扰；

(6)防干扰强：添加UDG酶，消化常规产物气溶胶污染，防止非特异性扩增

表2 产品性能验证总结

1.标准品线性

标曲范围：2fg/μL~200pg/μL，R2=1，扩增效率为 101.46%，各浓度检测值 CV<15%。

图1. E.coli RNA标曲线性图（左）和扩增曲线线性图谱（右）

2.基质加标回收（准确性验证）

用5份不同背景溶液（高蛋白、高核酸、高盐、高低pH）对同一浓度样本（200fg/μL的E.coli RNA）提取，每种背景溶液进行2个提取重复，每个提取做3个测试重复，分析样本回收率和CV。对于不同背景溶液的RNA样本回收率均在70%~130%之间，CV均<10%。

表3  模拟样本加标回收率

3.定量下限验证（1 fg/μL）

检测5fg/μL、2fg/μL、1fg/μL的E.coli RNA，每个浓度10个重复。结果显示，在1fg/μL及以上浓度，CV<20%，即E.coli宿主细胞RNA残留检测试剂盒的定量限为1fg/μL。

图2. 1fg/μL E.coli RNA qPCR检测结果

表4. E.coli RNA定量限检测结果

**完整验证原始数据可查阅配套《产品性能验证报告》。