从“挑克隆”到“批量测序”：Y2H-seq 让你的酵母双杂交筛库效率起飞
27
2026-06-15
做酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid, Y2H）的朋友都懂：当你辛辛苦苦筛完文库，平板上长出成百上千个阳性克隆时，心情是又喜又悲——喜的是信号不少，悲的是……这么多克隆，我一个一个挑、一个一个抽质粒、一个一个送Sanger测序，手是要断的。
别慌，二代测序（NGS） 来拯救你了。把传统“一个一个审”变成“集体阅兵”，这就是 Y2H-seq 的核心思路。今天我们就来聊一聊，如何用二代测序技术让酵母双杂交筛库变得高效、省力、数据量爆炸。
一、传统 Y2H 筛库的痛点
传统流程：
涂布筛选平板 → 长出阳性单克隆 → 逐个挑取 → 抽质粒 → 转化大肠杆菌扩增 → 抽质粒 → Sanger 测序 → 序列比对。
痛点：
❎ 阳性克隆数量多时（>100个），人工操作量极大，容易漏掉低丰度互作。
❎ Sanger 测序通量低，单个反应只能读一条序列，成本随克隆数线性增长。
❎ 假阳性干扰严重，没有定量信息，难以判断哪些互作更可信。
二、Y2H-seq：二代测序如何降维打击？
Y2H-seq 的核心是：将所有阳性克隆混合在一起，批量抽提质粒，直接构建测序文库，上机测序。
这样你得到的不是几十条序列，而是成千上万条序列 + 每个互作蛋白的出现频次。
诱饵验证：将目标基因克隆到 BD 载体（如 pGBKT7），转化酵母感受态细胞。
⚠️ 自激活检测：如果诱饵本身就能激活报告基因，需要切除转录激活域或改用更严格的报告菌株。
cDNA文库构建：从目标组织/细胞提取 RNA → 反转录为 cDNA → 克隆到 AD 载体（如 pGADT7）→ 转化大肠杆菌，构建 cDNA 文库。
✅ 质检要求：库容量 > 1×10⁶ CFU，插入片段平均 > 1 kb。
-
将诱饵菌株（α 型）与文库菌株（a 型）进行 mating（酵母交配），获得二倍体酵母。
-
涂布在 高严谨度筛选平板（SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade）上，只有诱饵与猎物真正互作的克隆才能生长。
-
培养 3–7 天后，平板上长出的所有克隆都是候选阳性互作。
-
直接刮板：将所有阳性克隆从平板上刮下来，混合成一个“阳性池”。
-
抽提酵母总质粒：包含 BD‑Bait 质粒和 AD‑猎物混合质粒。
-
电转化大肠杆菌 + 氨苄筛选：BD 质粒不携带氨苄抗性，只有 AD‑猎物质粒能在大肠杆菌中生长，从而特异性富集所有猎物质粒。
-
大抽质粒：获得纯化的 AD‑猎物混合质粒库。
✅PCR扩增插入片段后，可以直接进行三代PCR全长测序（13306ES）直接获得插入片段的全长序列。（为啥？当然是国产三代纳米孔测序试剂和设备足够便宜和准确呀，哈哈哈）
-
数据质控：FastQC + Trimmomatic 去除低质量序列。
-
序列比对：使用 BLAST 将每条序列比对到参考基因组或 NCBI 数据库，得到对应基因。
-
频次统计：计算每个基因在阳性池中出现的次数。
✅ 出现频次越高的基因，是真互作的可能性越大（假阳性通常只出现 1 次，真阳性可能重复几十次）。
-
功能富集分析：对高频基因进行 GO 和 KEGG 富集，了解互作蛋白的功能偏好。
-
验证：从高频基因中挑选 TOP 候选（例如出现 ≥10 次），逐一进行 回转验证 和 Co‑IP 验证。
三、Y2H-seq 的三大优势
|
对比项 |
传统 Sanger 测序 |
Y2H‑seq（NGS） |
|
阳性克隆处理 |
逐个挑取 |
批量刮板混合 |
|
测序通量 |
≤96 个/批 |
成千上万 |
|
结果信息 |
基因列表 |
基因列表 + 出现频次 |
|
假阳性控制 |
依赖后期验证 |
频次过滤 + 验证 |
|
成本（大规模） |
线性增长，较高 |
边际成本低 |
✅ 高通量：一次测序可以获得上千个阳性克隆的序列。
✅ 半定量：出现频次帮助筛选高置信度互作。
✅ 省时省力：告别“挑克隆挑到手抽筋”。
四、常见坑位与解决方案
1. 自激活假阳性
现象：诱饵蛋白单独就能激活报告基因。
解药：构建截短体切除激活域，或使用多报告基因菌株（同时依赖 His3 和 Ade2）。
2. 移码突变
现象：测序结果出现乱码，无法正确翻译蛋白序列。
解药：使用商业化的 三框文库，保证每个基因至少有一个正确阅读框；或分析测序峰图手动校正。
3.非特异性结合假阳性
现象：某些蛋白非特异性地激活报告基因，但实际不与诱饵互作。
解药：必须进行 回转验证（重新共转化诱饵+猎物质粒）和 Co‑IP 验证。
4. 文库质量差
现象：库容量低或插入片段短，导致漏筛。
解药：构建文库时确保库容量 >1×10⁶，平均插入片段 >1 kb。
五、结语
Y2H-seq 并不是要完全取代传统的 Sanger 验证，而是为 大规模、高通量 的互作筛选提供了利器。二代测序帮你快速海选“嫌疑人”，但最终的“定罪”还得靠回转验证和 Co‑IP 这些金标准。
如果你的实验室正在做酵母双杂交，而且阳性克隆动不动就上百个，不妨试试 Y2H-seq——让数据跑起来，把你的双手从牙签和离心管中解放出来。
祝大家的筛库实验，假阳性少一点，真互作多一点，paper 发得快一点！
产品推荐：
|
实验步骤 |
产品名称 |
产品货号 |
|
酵母文库制备和筛选 |
DMSO 二甲基亚砜（细胞培养级） |
|
|
DH5α Fast Chemically Competent Cell F |
||
|
Ampicillin, Sodium Salt 氨苄青霉素钠 |
||
|
Adenine 腺嘌呤 |
||
|
Aureobasidin A （AbA）金担子素A |
||
|
PCR扩增 |
2× Hieff Canace® Plus PCR Master Mix (With Dye) 高保真酶预混液 |
|
|
质粒提取 |
MolPure® Plasmid Mini Kit 质粒小量提取试剂盒 |
|
|
酵母质粒提取试剂盒 |
||
|
筛库时NGS文库构建 |
Hieff NGS® Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina（for 50ng） |
|
|
Hieff NGS® OnePot Pro DNA Library Prep Kit V4 二代DNA酶切建库试剂盒 |
||
|
Hieff® LongSeq Amplicon End repair and Ligation Module（三代PCR全长建库试剂盒） |
||
|
纯化和分选磁珠 |
Hieff NGS® DNA selection Beads (Superior Ampure XP alternative)DNA纯化分选磁珠 |
|
|
Hieff NGS® DNA Selection Beads V2 DNA 分选磁珠 V2 |
||
|
定量试剂和设备 |
1× dsDNA HS Assay Kit |
|
|
dsDNA BR Assay Kit/ BR |
||
|
核酸定量仪荧光计Qubit（96通道） |
||
|
CoIP实验 |
rProtein A/G IP/Co-IP Kit 蛋白A/G免疫(共)沉淀试剂盒 |
|
|
WB实验 |
||
|
琼脂糖凝胶电泳 |
||
*参考文献
W. S et al. (2017). CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping. Nat Methods. 2017 . Erratum in: Nat Methods. 2023 Mar.
J. ME. et al. (2023). Next-Generation Yeast Two-Hybrid Screening to Discover Protein–Protein Interactions. In: Mukhtar, S. (eds) Protein-Protein Interactions. Methods in Molecular Biology.
