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20 世纪 90 年代，依赖 PCR 的传统单细胞扩增技术存在覆盖不均、保真度低、扩增偏差严重等缺陷，极大限制单细胞研究发展。phi29 DNA聚合酶最早由布兰科和萨拉斯于1984年从表达P2基因的大肠杆菌细胞中分离得到，具有极高的持续合成能力，每次与引物模板结合平均能添加70000个核苷酸。以单链M13 DNA为模板时，该聚合酶会进行滚环复制模式，通过其链置换活性反复复制环状模板，产生由串联的M13重复序列组成的产物。该DNA聚合酶具有3′-5′核酸外切酶校对活性，这使得其内在错误率极低，为10⁻⁶ - 10⁻⁷，MDA产物中突变的积累速率仅为10⁻⁵ - 10⁻⁶，几乎比使用Taq DNA聚合酶的PCR低1000倍。2005 年后，随着二代测序技术成熟，加之未培养微生物、肿瘤异质性、胚胎遗传学检测等科研需求激增，MDA 凭借高保真、长片段、扩增均一的优势，成为单细胞全基因组扩增主流方法。

MDA（Multiple displacement amplification，多重置换扩增技术）测序方法是一种高效的单细胞全基因组扩增测序方法。单细胞中基因组DNA含量极低（飞克级），MDA法通过随机六聚体引物和φ29 DNA聚合酶，在等温条件下对单细胞基因组DNA进行指数扩增，产生50-100kb的核酸片段，为后续测序提供足够量的DNA模板。

第一步：随机引物结合。反应体系中的随机六聚体引物（通常为硫代磷酸修饰，可抵抗聚合酶的3'→5'核酸外切酶活性），会随机结合到基因组DNA模板的任意序列上——由于引物是随机序列，能够覆盖整个基因组的所有区域，确保扩增的全面性。

第二步：链置换DNA聚合酶介导的DNA合成与链置换。所使用的链置换φ29 DNA聚合酶具有三个关键特性：

1️⃣ 肿瘤单细胞研究

（循环肿瘤细胞CTCs、肿瘤异质性分析）

增殖时的分化和突变的积累是肿瘤组织高度异质性的形成原因，这也是肿瘤细胞可以逃离机体免疫细胞存活和干扰肿瘤治疗的主要因素。基于单细胞测序技术的各种不同肿瘤组织异质性的相关研究层出不穷，如乳腺癌、肺癌、脑癌、直肠癌、膀胱癌、白血病和黑色素瘤等。通过将单个细胞基因组信息和关键功能信号通路进行联合解析，找到引起肿瘤组织形成、生长和转移的突变相关关键因子，这些关键因子将极大地提高肿瘤化学疗法的效能。

2️⃣ 微生物组研究

（难培养微生物单细胞测序、菌群多样性分析）

以往，复杂微生物群落普遍存在生物量偏低、优势菌群富集的特点，极大限制了 PCR、基因芯片、宏基因组测序等分子技术在微生物鉴定与群落解析中的实际应用。同时，多数环境微生物难以体外纯培养，长期以来无法获得单一微生物的纯净核酸样本。

依托 MDA 介导的全基因组扩增策略，可高效获取未培养微生物、低丰度环境微生物的基因组信息，大幅提升难培养微生物的鉴定效率与物种解析深度。目前，MDA 已成为微生物鉴定及微生物生态学研究中不可或缺的分子技术。（ The ISME Journal, 2(3), 233–241.）

利用单细胞扩增技术和NGS技术对辅助生殖过程中体外培养的卵裂期或囊胚期胚胎进行检测，既单细胞测序全基因组扩增（WGA），该技术可检测全部的23对染色体非整倍体、≥4Mb的染色体片段缺失和重复、≥10Mb且比例≥30%的嵌合和夫妇一方或双方已知1-4 Mb遗传型CNVs。测序数据量1-2 M左右。

在反刍动物繁殖育种快速发展的背景下，胚胎基因组选择（EGS）技术凭借多元化应用价值，逐渐成为该领域的重点研究方向。该技术能够实现大规模同胞胚胎的快速筛查，优选性别合理、遗传性状优良的胚胎开展移植；还可早期识别存在隐性致死基因缺陷或染色体异常的胚胎并及时淘汰，从源头减少有害遗传基因扩散。结合高强度选育模式，可进一步压缩世代间隔，助推育种工作高效推进。针对胚胎细胞样本微量的特点，全基因组扩增（WGA）技术可高效扩增痕量 DNA，保证基因分型的准确性与稳定性，为 EGS 技术赋能反刍动物良种培育、提升整体育种水平提供了强有力的技术支撑。

在法庭科学实践中，现场环境和案情的复杂性往往使得法医DNA检验面对各种疑难生物检材，如模板DNA含量低、降解程度高、混合分型以及含有抑制物等。如何提高疑难检材的法医DNA分型成功率也一直是法医学亟待解决的问题。单细胞测序技术的不断成熟，给法医疑难检材的检测提供了一些新的研究思路。

单细胞基因组测序是探索细胞异质性、解析稀有细胞遗传特征、推动肿瘤研究、PGT、胚胎育种与微生物精准鉴定的核心技术。然而，单个细胞仅含皮克级（pg）DNA，远低于常规测序建库需求，痕量 DNA 高效扩增与高质量文库构建成为技术瓶颈。永利3044集团官网深耕分子生物学试剂研发多年，依托强大的酶工程与建库技术平台，重磅推出单细胞基因组测序完整解决方案，覆盖DOP-PCR、MDA全基因组扩增与酶切法建库全流程，为单细胞水平精准基因分型与测序分析提供一站式、高性能支撑。

实验以 0~5 个微量细胞为起始样本，采用 MDA 法单细胞全基因组扩增（WGA）获得扩增产物；取 100 ng WGA 产物作为建库起始模板，经 6 轮 PCR 预扩增、25 分钟酶切片段化处理后，构建基因组测序文库，文库主峰片段长度集中在 300 bp；酶切接头连接后采用 0.6× 磁珠比例进行纯化，文库扩增结束后以 0.9× 磁珠二次纯化，最终洗脱体积设定为 42 μL，完成标准化文库制备。

0~5个细胞样本，试剂盒扩增产物大小在2-100 kb之间，产量≥ 5 μg；12512的CV值低于竞品C，扩增均一性更好。