细胞转染 | RBE大鼠胆管上皮细胞siRNA转染案例
15215
2026-03-19
实验所用转染试剂
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试剂名称 |
货号 |
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40807ES |
细胞培养与传代（T25）
润洗：吸弃旧培养基，加入3-4 mL常温PBS轻晃润洗10-20秒后吸弃。
消化：加入1 mL胰酶润湿瓶底，37°C孵育消化。
吹落：待细胞间隙变大、形态变圆时，直接用胰酶轻轻吹打下细胞。
终止：加入2-3 mL完全培养基终止消化，吹打混匀成细胞悬液。
接种：收集悬液，200 ×g离心3-5分钟，弃上清，用新鲜培养基重悬后分瓶，补足培养基继续培养。
细胞转染（6孔板）
一、 实验前准备
1. 细胞准备：转染前24小时，用胰酶消化并重悬细胞后，进行细胞计数。以合适的密度（5E5/mL）将细胞接种于6孔板中，每孔加入2mL完全培养基。目标是转染时细胞的汇合度达到60% - 80%。
2. 试剂准备：
o siRNA： 合成高质量siRNA，通常设计3个不同siRNA进行验证，初始浓度调整成20μM。
o 转染试剂： 将RNAiBoost试剂在4°C冰箱外静置回温，使用前轻轻吹打。
o 无血清培养基： 准备用于稀释siRNA和转染试剂的基础培养基（如Opti-MEM）。
二、 细胞转染
1. 稀释siRNA：吸取5 μL siRNA溶液与25 μL Enhancer增强剂溶液充分吹打混匀；
2. 稀释转染试剂：吸取10μL RNAiBoost体外转染试剂溶液与（1）中溶液混合，并充分吹打混匀，室温孵育5 min。
3. 细胞转染：孵育结束后，向（2）中混合溶液加入60 μL的opti-MEM转染稀释液，并充分吹打混匀，随后将混合后的100μL转染复合物加入到6孔板的一个孔中，摇动混匀培养板中的液体，可根据需要的孔量进行配制转染复合物。
4. 细胞培养及检测：将细胞放回37°C、5% CO₂培养箱中培养；24 -48 h后检测细胞基因沉默水平。
四、 转染后处理
1. 换液：转染后4-6小时，仔细观察细胞状态。若出现明显毒性，应吸弃含复合物的培养基，更换为2 mL新鲜预热的完全培养基。若细胞状态良好，可以不换液。本次实验不换液
2. 检测：通常培养48小时后，提RNA进行检测。本次实验转染后48h进行qPCR检测。
小贴士：
1、如果转染后有显著的细胞毒性，可以在6h换液或将用量减半，可以避免细胞毒性问题；
2、如果转染效率比较低，可以通过提高转染试剂用量，能够有效提高转染效率；
3、稀释siRNA和转染试剂，最好使用opti-MEM；
4、转染试剂兼容血清和双抗，但是稀释质粒和转染试剂用的必须是无血清无双抗培养基。
5、需严格按照表格中推荐用量进行转染复合物制备，如若增加或减少用量，需要等比例减少，以6孔板为例，若按照终浓度50nM进行实验，则按照说明书配置100ul转染复合物即可，若需要用量翻倍，需要配置200ul转染复合物添加到孔板中；相反，若用量减半，按照表格推荐用量，配置好的100ul转染复合物，只需要添加50ul即可。
实验结果分析
在RBE大鼠胆管上皮细胞转染siRNA，用永利3044集团官网 RNAiBoost转染，并通过qPCR检测转染效率。
数据来源：鼓楼医院
使用永利3044集团官网 RNAiBoost转染试剂在RBE大鼠胆管上皮细胞转染siRNA，结果显示，永利3044集团官网RNAiBoost 转染试剂能够高效转染，显著降低目的基因表达。
不同培养皿RNAiBoost转染试剂用量使用指南
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细胞培养板 |
细胞培养基体积 |
siRNA溶液 （原液浓度20 μM） |
增强剂 |
转染试剂 |
无血清培养基体积 |
转染复合物体积 |
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24孔板 |
500 μL |
1.25 μL |
6.25 μL |
2.5 μL |
15 μL |
25 μL |
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12孔板 |
1.0 mL |
2.5 μL |
12.5 μL |
5 μL |
30 μL |
50 μL |
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6孔板 |
2.0 mL |
5 μL |
25 μL |
10 μL |
60 μL |
100 μL |
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