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cfRNA的特征及提取方法

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2026-03-17

cfRNA（细胞游离RNA）全称cell-free RNA，是指游离于人体体液（如血浆、血清、尿液等）中的RNA分子，广泛应用于液体活检、疾病早期诊断、病情监测等领域。其核心特征表现为含量极低、高度碎片化、种类混杂且易降解。

一、cfRNA的核心特征

（一）存在形式

cfRNA广泛存在于人体各类体液中，其中血浆、血清是最常用的检测样本，此外在尿液、脑脊液、胸腔积液、腹水等体液中也可检测到。其存在形式主要分为三种：一是游离态，即未与任何蛋白或载体结合，直接存在于体液中；二是蛋白结合态，与核酸结合蛋白结合形成复合物，一定程度上可抵抗RNase的降解；三是囊泡包裹态，被外泌体、微囊泡等囊泡结构包裹，是cfRNA最稳定的存在形式之一，可有效保护RNA不被降解。

（二）理化特性

cfRNA的理化特性是其提取难度大的主要原因，核心特性如下：

1. 含量极低：在血浆中，cfRNA的浓度仅为pg–ng级/mL，远低于细胞内RNA的浓度；

2. 高度碎片化：由于体液中RNase的作用，以及细胞释放RNA时的降解，cfRNA多为短片段，其中mRNA片段多小于200 nt，长链RNA的完整片段较少；

3. 易降解：RNase广泛存在于环境中（如皮肤、唾液、实验器材等），且活性极强，cfRNA极易被RNase降解；

4. 易受污染：提取过程中易受到血细胞破裂释放的细胞内RNA、基因组DNA（gDNA）的污染，这些污染物会干扰下游实验结果，因此提取过程需同时去除gDNA和杂蛋白。

（三）生物学特点

cfRNA具有显著的生物学优势，使其成为理想的液体活检标志物：

1. 组织/疾病特异性：不同组织细胞释放的cfRNA具有独特的表达谱，例如肿瘤细胞释放的cfRNA会携带肿瘤相关基因的特征，可用于肿瘤的分型与定位；

2. 实时性：cfRNA的半衰期较短（通常为数小时至数天），能够实时反映机体的生理、病理状态，可用于疾病的动态监测、治疗效果评估；

3. 无创性：获取cfRNA的样本（如血液、尿液）可通过无创或微创方式采集，相较于组织活检，对患者的创伤小、依从性高，适合大规模筛查与长期监测。

二、cfRNA的提取方法与操作流程

整个流程分为前处理和提取两个环节。

（一）前处理环节

1. 样本采集与保存

优先选择血浆作为提取样本（血清中凝血过程会释放细胞内RNA，易造成污染），采集时需注意：

1. 抗凝剂选择：使用EDTA或枸橼酸钠抗凝管，严禁使用肝素抗凝管；

2. 样本稳定：采集后若不能立即处理，需使用RNA稳定管，可在室温下稳定保存24–48小时；

3. 避免污染：采集过程中严格无菌操作，避免皮肤接触样本、实验器材。

2. 样本离心分离

采血后需在1小时内进行低温离心，彻底去除血细胞、细胞碎片及杂质，步骤如下：

1. 第一次离心：4°C、1600×g，离心10分钟，此时血细胞会沉淀在管底，上清液为血浆；

2. 第二次离心：小心吸取第一次离心的上清液，转移至新的无RNase离心管中，4°C、16000×g，离心10分钟，去除上清液中残留的细胞碎片和微小杂质；

3. 上清转移：离心后吸取上清液，转移至新的无RNase离心管中，避免触碰管底沉淀，此时的上清液即可用于后续cfRNA提取。

若分离后的血浆样本不立即提取，需进行分装冻存，加入适量RNase抑制剂，-80°C冰箱保存，可保存6–12个月；解冻：使用时从-80°C取出，立即置于冰上解冻，解冻后轻轻颠倒混匀，避免剧烈震荡，解冻后尽快使用，不可反复冻融（建议不超过3次）。

（二）主流提取方法

目前cfRNA的主流提取方法主要有磁珠法、硅胶柱法、有机抽提法三种，其中磁珠法和硅胶柱法因操作简便、纯度高、回收效率好，广泛应用于科研与临床检测。

提取方法	磁珠法	硅胶膜柱法	有机提取（以trizol法为代表）
原理	将裂解后的样本与磁珠混合，磁珠可以选择性结合RNA，用洗涤缓冲液洗涤磁珠，然后将 RNA 从磁珠中洗脱出来。	将裂解后的样本上样至柱上，柱子中含有选择性硅胶，离心使RNA通过柱子的硅胶膜，最后洗脱下来。	通过有机提取和 RNA 沉淀实现 RNA 分离。
纯度	最高	高	中等
提取体积	中等到高	中等到高	低
优点	适合高通量样本和临床检测	易于使用，操作总时长相比磁珠法更短。可以进行微量 RNA 的提取。	比磁珠法和柱提法都要快，单次提取1.5-2h完成。适用范围广，操作体系大，得率高，成本低。
劣势	单次实验相比硅胶膜柱法耗时较长。	不能上提取仪进行大批量提取。	试剂毒性大（异硫氰酸胍、酚），需要在通风处操作。

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