pCMV质粒 | 100mL菌液质粒大提案例
7426
2026-01-16
实验所用试剂清单
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试剂 |
无水乙醇 |
异丙醇 |
19037ES无内毒素质粒大量提取试剂盒V2 |
60401ES动态浊度法内毒素检测鲎试剂 |
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耗材 |
50 mL离心管 |
2 mL细心管 |
50 mL离心管架 |
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设备 |
Thermo角转子离心机 |
移液器 |
琼脂糖凝胶电泳设备 |
Nanodrop |
操作步骤
菌体收集、裂解与澄清
1.菌体收集： 通过多次离心收集所需要的菌体量。
取100 mL菌液分装到2个50 mL离心管中（共3个样本，6管），6000×g离心3 min，弃上清。
2. 重悬菌体：加入10 mL溶液SI，振荡至无可见菌块。
3. 裂解处理：加入10 mL溶液SII，轻柔翻转混匀4~10次，形成透明裂解液（裂解时间4 min）。
4. 中和并澄清沉淀：加入8 mL溶液SIII，100 µL RNase A，翻转混匀10次，室温静置10 min，10000×g离心5 min。
5.使用推杆过滤器将上清液过滤至50 mL尖底离心管（得约25mL上清），加10 mL 结合液PB混匀备用。
质粒纯化
6.吸附柱平衡：（建议在处理上清液期间处理）向吸附柱E2加4 mL平衡液BS，静置2 min，6000×g离心2 min，弃废液。
7. 吸附柱吸附质粒：步骤5所得混合液，通过多次离心，将样品吸附到吸附柱E2柱中。混合液用量9 mL/次，分4次离心，6000×g离心2 min。。
8. 漂洗：加入8 mL溶液W1漂洗一次，8 mL漂洗液WS（漂洗两次），每次6000×g离心2 min（
9. 干燥：10000×g空离5 min，并室温放5 min彻底去除乙醇。
质粒洗脱
10. 加入1.2 mL洗脱缓冲液EB，室温静置5 min，10000×g离心3 min收集洗脱液。
细节注意
1.结合液的比列一定要准确，不能加少，可以略多加；
2.菌体一定要打散，如果成块裂解不完全，会影响质粒得率；
3.加入无水乙醇和异丙醇之后，一定要剧烈晃均匀。
质检结果
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样本 |
浓度（nanodrop） |
A260/A280 |
A260/A230 |
内毒素残留 |
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1 |
1165.675 |
1.89 |
2.2 |
≤1 EU/μg |
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2 |
1417.042 |
1.94 |
2.35 |
≤1 EU/μg |
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3 |
1435.989 |
1.93 |
2.1 |
≤1 EU/μg |
实验结论
3个pCMV质粒样本，100mL菌液提取质粒，试剂盒采用永利3044集团官网 19037ES无内毒素质粒大量提取试剂盒V2，质粒的产量、纯度、内毒素残留满足需求，无RNA残留，超螺旋比列高，整体结果符合下一步转染实验的质控标准。
数据来源：上海某CRO企业
