HEK293细胞应用及其残留DNA质控

HEK293细胞是一种人胚肾细胞系，因其对生长和培养环境要求不高、易于转染，以及相比于常用的CHO细胞翻译后修饰（PTM）能力更为强大的特点，目前在工业内也被广泛用于抗体蛋白生产、疫苗中的病毒样颗粒生产、细胞和基因治疗中的病毒载体生产等领域。但也有实验证明，HEK293注入裸鼠中可成瘤，所以HEK293宿主细胞残留成分是生物制品质量控制中一个重要环节，需要被控制在可接受的水平。

严格的纯化工艺可以去除一部分宿主细胞DNA（HCD）等残留杂质成分，但产品中仍然可能会有HCD残留，这些残留的外源宿主细胞DNA会引发潜在的安全问题（如潜在致瘤性、传染性，甚至增加免疫源性或导致突变），所以HCD检测项目是生物制品生产工艺中重要的质量检测指标之一。

残留DNA风险及法规监管要求

WHO和各国药物注册监管机构均对生物制品中外源宿主DNA残留提出了监测和控制要求，以确保生物制品的安全性及质量可控性。

WHO和美国FDA现行指导方针推荐成品中残留DNA不高于10 ng/剂，美国FDA还指出生物制品宿主细胞DNA残留DNA不高于100 pg/剂。欧洲药典通则规定生物制品残留DNA限度大多为不超过10 ng/剂。中国药典2020年版三部规定，以细胞基质生产的生物制剂外源宿主细胞DNA残留量不能超过100 pg/剂，以细菌或真菌基质生产的疫苗DNA残留量不能超过10 ng/剂。

除需对DNA的残留量进行控制外，DNA残留片段大小分布也是确定其相关风险因素的重要指标。有研究表明，一个功能基因至少在200bp以上，因此大于200bp有可能会有一定的致病性，而且残留DNA片段越大，生物制品的风险等级越高。DNA片段大小对应风险等级如下表：

DNA片段大小风险等级划分

注：风险程度依据风险等级递增

美国FDA在《Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs) 》行业指南中建议将非致瘤性连续细胞的残留DNA量限制在10 ng/剂以下，DNA大小限制在约200bp以下。

2022年5月，国家药品监督管理局药品评审中心（CDE）发布的体内基因治疗产品要学研究与评价技术指导原则（试行）中也明确指出，需对DNA残留量和残留片段大小进行控制，建议尽量将DNA残留片段的大小控制在200bp以下。

残留DNA片段分析方法

目前，检测宿主细胞残留DNA含量的方法都相对成熟，而且药典法规也有明确规定，如《中华人民共和国药典》2020年版第三部规定，外源性DNA残留检测采用DNA探针杂交法、荧光染料色法和定量PCR法。

然而，关于残留DNA片段大小的检测与分析，目前还没有特定推荐的方法。

目前，行业内对于残留宿主细胞DNA片段分析，主要是利用毛细管电泳的方法。研究者们开发了一种基于毛细管凝胶电泳与敏感激光诱导荧光（CGE-LIF）检测残留DNA分子大小的方法，可以检测生物制品中残留DNA的大小，实验表明，大多数宿主细胞残留DNA片段大小为50-2000bp。除了毛细管电泳法外，实时荧光定量PCR（qPCR）法也被用于进行生物制品中生产用细胞相关的DNA片段分布的分析。且qPCR法相比于CGE-LIF操作更简单，耗时更短。

针对上述情况，永利3044集团官网自主研发了HEK293残留DNA片段分析试剂盒，采用荧光探针qPCR法原理，设计了四种不同的扩增片段（82bp、133bp、227bp、515bp），用于定量检测样本中HEK293宿主细胞残留DNA片段的大小分布情况。样本类型包括：慢病毒上清液、腺相关病毒AAV上清液、HEK293细胞裂解液等。还研发了与之配套使用的宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒，以及配套的自动化核酸提取仪器。

HEK293残留DNA片段分析Kit产品性能

符合法规：按照Chp、USP、ICH等要求进行全面验证，性能符合中外法规标准；

保障品质：试剂盒原材料全自主研发，qPCR Mix等酶产品在超洁净酶工厂生产；

配合审计：保障试剂盒生产工艺稳定，批间差可控，有完善的审计文件；

灵敏度高：定量限可达10fg/μL水平；

专属性强：特异性检测HEK293细胞残留DNA，不受其他外源基因组DNA干扰；

防干扰强：添加UDG酶，消化常规产物气溶胶污染，防止非特异性扩增

产品信息

产品	货号	品名	规格
样本前处理试剂盒	18461ES	MolPure® Magnetic Residual DNA Sample Preparation Kit磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒（瓶装）	25T/100T
	18462ES	MolPure® Mag32 Residual DNA Sample Preparation Kit FA磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒FA（预封装）	2×16T/6×16T

核酸提取仪器	80501ES	Auto-Pure 32A automated nucleic acid extraction system Auto-Pure 32A全自动核酸提取仪	32通量
残留DNA片段分析试剂盒	41316ES	HEK293 Host Cell Residue DNA Size Analysis Kit HEK293 宿主细胞残留 DNA 片段分析试剂盒	4×50T/4×100T

参考文献

[1]《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》，国家药品监督管理局药品审评中心，2022年5月。

[2] 闫璐瑶等，宿主细胞残留DNA片段大小分布检测方法的建立及验证[J].中国生物制品学杂志，2021年3月第34卷第3期。

[3] U.S. FDA. Guidance for Industry: Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs).

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