Q：构建得到的文库产量低的原因？

A：1、DNA 质量低，样本中含抑制物（抑制酶活性等）

Input DNA 制备过程中带入的高浓度金属离子螯合剂或者其他盐，可能会影响末端修复以及 A 尾添加等步骤的反应效率，DNA 在TE 溶液中进行片段化，不要在无菌超纯水中进行。

2、RNA 污染

样本中存在RNA 污染会导致DNA 定量不准确，使文库构建时DNA 上样量不足。

3、PCR free 的时候上样量不足

当使用完整接头且Input DNA 大于 200 ng 时候，不用 PCR 扩增。如果文库拷贝数过低不能进行直接测序，可在接头连接完成后对DNA 文库进行PCR 扩增。

4、接头出现降解：接头存储不当会出现降解，影响连接效率。一般稀释过的接头可在室温放置 48h。

判断接头是否降解的方法：

a.用安捷伦 2100 毛细血管电泳检测，通过电泳条带大小判断；如果未发生降解，则条带大小大概为 62bp（complete adapter），如果发生降解，则无条带或条带很小。

b.用Qubit、酶标仪等检测仪器进行浓度测量，粗略判断接头是否降解。

检测方法：取 1uL，15uM 的complete 接头（12615ES-12618ES）若 Qubit 检测浓度 600ng/ul 左右，则

接头正常，反之若小于 600ng/ul，则接头可能降解成单链或小片段。酶标仪检测同理。

Q：最后一步扩增，短接头中Primer 和长接头的Primer 是否一致？

A：不一致。短接头建库：接头连接时候是连接一样的双端接头 PE Adapter,后期进行文库扩增再利用不同的 Index Primer 扩增出完整携带不同的DNA 文库。长接头建库：接头连接时候的连接的是带有不同Index 的完整接头，后期扩增的时候再用两端的通用引物 Primer Mix 扩增完整的文库，使用长接头时，若在PCR 扩增之前文库浓度就达到上机要求，则无需进行PCR 文库扩增。

Q：接头中index/Barcode 组合原则是什么？

A：碱基平衡，荧光平衡（详情可查看翊圣生物公众号微信软文一文全面解析 NGS 接头的奥秘）

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